小球藻培养基优化及脱氮效果

谢凤行，周 可，张峰峰，赵 琼，赵玉洁，杨建永，孙丽丽

（天津市农业生物技术研究中心，天津 300384）

小球藻是绿藻门（Chlorophyta）小球藻属（Chlorella）的一种普生性单细胞绿藻，在自然界分布广泛，它能利用光能自养，也能在异养条件下利用有机碳源进行生长繁殖，易于人工培养.小球藻的粗蛋白含量很高，占干重的50%以上，还富含不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素等[1].由于小球藻营养价值全面且均衡，因此被广泛应用于保健食品[2]、天然产物类胡萝卜素[3]、水产养殖饵料[4]、畜牧饲料添加剂[5]等多个领域.随着名优特水产品养殖业的迅速发展，在引种驯化、幼苗繁殖过程中，幼苗的开口饵料生产是关键环节.小球藻的蛋白质含量高，含动物体所需的20 种氨基酸、多种维生素和微量元素，以及亚麻酸、亚油酸、胡萝卜素等，营养成分丰富均衡，可直接作为鱼、虾、贝类的优质饵料[6]，促进养殖生物的生长[7].小球藻还能降解水体中的亚硝酸盐、氨氮、硝酸盐和磷酸盐[8-11]，从而有效净化养殖水体.

小球藻的生长周期相对较长，生物量低，限制了它的规模生产和推广应用.虽然有研究通过优化小球藻生长所需的碳、氮、磷含量提高了小球藻的生长速率和生物量[12]，但多数是在实验室无菌条件下进行，不适宜在生产上大规模推广应用.本研究首先在无菌条件下对小球藻培养基成分进行筛选，采用正交实验方法对主成分含量加以优化，以此为基础，在开放培养条件下进行改良和放大实验，并研究了小球藻对高浓度氮的去除效果，为开发小球藻应用于水产养殖饵料及高氮污水处理提供技术支撑.

1 材料和方法

1.1 材料

藻种：藻种为本实验室从鱼虾混养池中分离保存，将小球藻藻种从试管斜面上接种至改良的DS 培养基平板中培养，再从平板中挑取单藻落至液体培养基中，培养至对数生长期作为藻种，藻细胞浓度约为4.0×106CFU/mL.

本实验室改良的 DS 培养基（L-1）：0.3 g（NH2）2CO、0.05 g KH2PO4、0.3 g MgSO4·7H2O、0.008 g FeSO4·7H2O、1.0 g NaHCO3、0.3 g NH4Cl.

SE 培养基（L-1）：0.25 g NaNO3、0.175 g K2HPO4、0.075 g KH2PO4、0.025 g MgSO4·7H2O、0.025 g NaCl、0.025 g CaCl2·2H2O、0.005 g FeCl3·6H2O.

JM 培 养基（L-1）：0.93 g NaHCO3、0.46 g KNO3、0.02 g K2HPO4、0.4 g MgSO4·7H2O、0.06 mg VB1、1.8 μg VB12、2 μg 生物素.

BG11 培养基（L-1）：1.5 g NaNO3、0.036 g CaCl2·2H2O、 0.02 g Na2CO3、 0.075 g MgSO4·7H2O、 0.030 5 g K2HPO4、 0.004 g K2HPO4·3H2O、0.006 g 柠檬酸、0.006 g柠檬酸铁氨、0.01 mg EDTANa2、1 mL A5 溶液、40 mL土壤浸提液.

ND 培养基（L-1）：1 g KNO3、0.237 g KH2PO4、0.088 g CaCl2·2H2O、0.04 g EDTA、0.03 g FeSO4·7H2O、0.204 g MgSO4·7H2O、1 mL A5 微量金属溶液.

A5 溶液（L-1）：0.287 mg ZnSO4·7H2O、0.16 mg MnSO4·H2O、 0.061 mg H3BO3、 2.5 μg CuSO4·5H2O、1.24 μg（Na）2MoO24·7H2O.

不含氮基础培养基（L-1）：0.3 g MgSO4·7H2O、0.008 g FeSO4·7H2O、0.75 g NaHCO3、0.03 g KH2PO4.

1.2 方法

1.2.1 不同培养基对小球藻生长的影响

根据文献[2，13-15]，选用改良的 DS 培养基、SE 培养基、JM 培养基、BG11 培养基和 ND 培养基，每种培养基配制300 mL，分装到250 mL 的三角瓶中，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌20 min.接10 mL 藻种，25 ℃下光照培养，光暗比为14 ∶10，光照强度为3 500～4 500 lux，每天定时摇动3 次，培养7 d 后取样.测量藻细胞浓度，筛选藻细胞浓度高的培养基配方.

1.2.2 不同糖浓度对小球藻生长的影响

配制改良DS 培养基2.1 L，分装到250 mL 三角瓶中，每瓶装培养基 100 mL，分别加入 0、1、2、3、4、5、6 g/L 葡萄糖，每个质量浓度设3 个重复，115 ℃灭菌20 min，接 10 mL 藻种，25 ℃光照培养，光暗比为 14 ∶10，光照强度为 3 500～4 500 lux，每天定时摇动 3 次，4 d后取样，测量藻细胞浓度.

1.2.3 正交实验优化小球藻培养基

选取改良的DS培养基的碳、氮、磷源，即（NH2）2CO（A）、NH4Cl（B）、KH2PO4（C）、NaHCO3（D）、葡萄糖（E）5 个因子，对每个因子设计4 个浓度梯度，采用L1645设计表进行正交实验，各因子的添加量和添加水平如表1 所示.培养基配好后分装到250 mL 三角瓶中，每瓶装培养基 100 mL，115 ℃灭菌 20 min，接藻种 10 mL，培养温度为 25 ℃，光照强度为 3 500～4 500 lux，光暗比为14 ∶10，每天定时摇动3 次，培养4 d 后测量藻细胞浓度.对优化的组合在三角瓶中进行验证实验.

表1 正交实验各因子的添加量Tab.1 Factors and levels of medium composition orthogonal test g/L

1.2.4 小球藻开放培养配方改良

在开放条件下对优化的小球藻培养基配方进行实验，即用250 mL 三角瓶装100 mL 未灭菌的培养基，敞口培养.发现在培养2 d 后界面形成菌膜，可能是因为葡萄糖作为有机碳源利于原介质中细菌生长.在培养基其他成分不变的情况下，设置葡萄糖质量浓度分别为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/L，培养小球藻4 d 后取样，测量藻细胞浓度和吸光度值.先在3.5 L 玻璃缸中对筛选的配方进行放大实验，培养小球藻3 d 后，转接至65 L 的玻璃缸中放大培养，之后在1 000 L 玻璃槽和1 000 L 塑料袋中进行放大实验，接种量均为 10%.采用自然光源，常温（25～30 ℃）培养3～5 d，取样测量藻细胞浓度.

1.2.5 小球藻对高浓度氮的去除效果

向不含氮和葡萄糖的基础培养基中分别加入氯化铵和硝酸钾，使NH+4-N 和NO-3-N 的质量浓度分别为100、200、300、400、500、750、1 000 mg/L，pH 值为 6.0.按10%的接种量接种，光照强度3 500～4 500 lux，25 ℃培养.48 h 取样，7 500 r/min 离心10 min.采用纳氏试剂光度法[16]测量上清液的氨氮含量，采用酚二磺酸紫外分光光度法[16]测量上清液的硝酸盐氮含量.

2 结果与分析

2.1 不同培养基对小球藻生长的影响

小球藻在不同培养基中的生长情况如图1 所示.

图1 不同培养基对小球藻生长的影响Fig.1 Effects of different mediums on the growth of Chlorella sp.

由图1（a）可以看出，小球藻在 JM 和 DS 培养基中的细胞浓度较高，分别达到8.73×106CFU/mL 和8.80×106CFU/mL，显著高于其他 3 种培养基中的浓度，JM 和DS 培养基之间的差异不具有统计学意义（P＞0.05）.小球藻含叶绿素，能利用太阳光照合成自身所需的能量物质，也有研究报道，小球藻能利用有机碳源进行异养生长[20]，因此在筛选的JM 和DS 培养基中分别添加1～3 g/L 的葡萄糖进行对比实验.由图1（b）可以看出，在JM 和DS 培养基中添加一定量的葡萄糖可以促进小球藻生长，在所设浓度范围内小球藻的浓度随培养基中葡萄糖添加量的增加而升高，说明此株小球藻具有异养生长特性.小球藻在改良DS 培养基中的藻细胞浓度显著高于JM 培养基中的浓度，因此后续实验选取改良的DS 培养基培养小球藻.

2.2 不同糖浓度对小球藻生长的影响

不同的葡萄糖浓度下小球藻的生长情况如图2所示.由图2 可以看出，小球藻的细胞浓度随培养基中葡萄糖浓度的升高而增大，葡萄糖质量浓度为5 g/L和6 g/L 时，藻细胞浓度显著高于其他处理，分别达到1.94×108CFU/mL 和 1.99×108CFU/mL，约为对照组的24 倍.葡萄糖的添加使小球藻生长实现倍增，说明该藻株可进行异养生长.

图2 不同糖浓度对小球藻生长的影响Fig.2 Effects of glucose concentration on the growth of Chlorella sp.

2.3 正交实验优化小球藻的培养基成分

5 个营养因子的正交实验结果如表2 所示，方差分析如表3 所示.由表2 可以看出，各营养因子的不同配比对小球藻生长有显著影响，藻细胞浓度变化范围较大，为 6.2×107～20.2×107CFU/mL.对各处理组中小球藻的浓度进行正交分析得知，利于小球藻生长的最佳组合为A1B3C2D1E3，即尿素的质量浓度为0.2 g/L、氯化铵的质量浓度为0.5 g/L、碳酸氢钠的质量浓度为0.75 g/L、磷酸二氢钾的质量浓度为0.03 g/L、葡萄糖的质量浓度为5 g/L.从极差大小分析可知，5 个因子对小球藻影响的程度依次为葡萄糖＞碳酸氢钠＞尿素＞氯化铵＞磷酸二氢钾.由方差分析可以看出，除磷酸二氢钾外其他4个因素对小球藻的生物量均有显著影响（P ＜ 0.05）.

表2 培养基优化直观分析结果Tab.2 Intuitive analysis results of the medium composition orthogonal test

表3 方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis

由于所选组合不在实验所设的16 个组合内，因此对其进行验证实验.结果表明，在优化的组合下培养4 d 后，小球藻藻细胞浓度达到2.15×108CFU/mL，为优化前的26 倍，所选组合得到了成功验证.

2.4 小球藻开放培养配方的改良

开放培养条件下，培养基中葡萄糖浓度对小球藻生长的影响如图3 所示.

图3 开放条件下不同糖浓度对小球藻生长的影响Fig.3 Effects of glucose concentration on the Chlorella sp.growth in open condition

由图3 可以看出，开放培养条件下，小球藻细胞浓度随葡萄糖含量呈先升后降的趋势，葡萄糖质量浓度为0.3 g/L 时，藻细胞浓度达到9.9×107CFU/mL，显著高于其他处理，是不加糖处理的12 倍.培养基中的葡萄糖不仅能给小球藻提供碳源，同时也是多数细菌的优质碳源，在开放条件下培养基中葡萄糖质量浓度超过0.5 g/L 时，滋生的细菌对小球藻生长产生一定的抑制作用.因此，开放培养条件下葡萄糖的适宜添加量为0.3 g/L.

筛选的小球藻开放培养配方在3.5 L 玻璃缸、65 L玻璃缸、1 000 L 玻璃槽和1 000 L 塑料袋中得到了成功放大，藻细胞浓度为 6.5×107～9.8×107CFU/mL，是不加糖培养基中藻细胞浓度的10 倍左右.此方法无需特殊装置，无需灭菌，适合大面积推广应用.

2.5 小球藻对氨氮的去除效果

小球藻对培养基中氨氮的去除效果如图4 所示.

图4 小球藻对氨氮去除效果Fig.4 NH4+-N removal efficiency of the Chlorella sp.

由图4 可看出，在所试浓度范围内小球藻对氨氮去除率比较接近，在71%～81%之间，但对氨氮的绝对去除量随着底物浓度的升高呈现上升趋势.当底物质量浓度为100 mg/L 时，小球藻对氨氮的去除量为71 mg/L，当底物质量浓度为1 000 mg/L 时，小球藻对氨氮的去除量达到787 mg/L，去除速率达到16.4 mg/（L·h）.这可能是因为小球藻处于旺盛的对数生长期，培养基中的氯化铵作为氮源被小球藻快速利用.3.40 mg/L；周连宁等[20]模拟小球藻污水脱氮实验发现，氨氮质量浓度低于35 mg/L 时，小球藻的脱氮率为78%.

2.6 小球藻对硝酸盐氮去除效果

小球藻对培养基中硝酸盐氮的去除效果如图5所示.

图5 小球藻对硝酸盐氮去除效果Fig.5 NO-3-N removal efficiency of the Chlorella sp.

由图5 可以看出，小球藻对硝酸盐氮的去除率和去除量均随底物浓度的升高呈上升趋势，去除率在61.4%～85.6%之间.底物质量浓度为1 000 mg/L 时，小球藻对硝酸盐氮的绝对去除量达到855.8 mg/L，去除速率达到17.8 mg/（L·h）.硝酸盐是小球藻培养基常用的氮源，硝酸盐氮的去除大部分也是因为小球藻的生长消耗所致.

3 讨论与结论

小球藻可以利用CO2或碳酸盐进行自养生长，部分藻种也可利用有机碳源进行混养生长或异养生长.孔维宝等[15]的研究表明，葡萄糖的添加显著促进了小球藻生物量的积累，且混养培养的生物量接近自养和异养生物量之和，因此提出混养是最佳的藻细胞培养方式.本研究在无菌培养条件下，添加5 g/L 的葡萄糖混养培养，其藻细胞浓度达到2.15×108CFU/mL，是自养培养的26 倍；在开放培养条件下，添加0.3 g/L的葡萄糖混养培养，藻细胞浓度也达到9.9×107CFU/mL，是自养培养的12 倍.这说明本研究中的藻株混养培养优于自养培养.

碳和氮是细胞原生质结构中的重要组成成分，对细胞的生长代谢活动具有重要意义，磷是小球藻正常生长所需元素之一.保持培养基中合适的碳、氮、磷比例，可使培养基中的氮、磷完全去除[23].本研究对培养基中的碳、氮、磷成分进行了正交优化，发现当尿素的质量浓度为0.2 g/L、 氯化铵的质量浓度为0.5 g/L、碳酸氢钠的质量浓度为0.75 g/L、 磷酸二氢钾的质量浓度为0.03 g/L、葡萄糖的质量浓度为5 g/L 时利于小球藻生长，且在所试的浓度范围内，葡萄糖、碳酸氢钠、尿素对小球藻的生长有显著影响，影响因子大小依次为葡萄糖＞碳酸氢钠＞尿素＞氯化铵.小球藻培养中常用的有机碳源有葡萄糖、乙酸钠、各种有机酸等，常用的氮源有 KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和尿素等，各种形态的碳、 氮对小球藻混养生长的影响不尽相同.研究表明，在混养情况下，混合氮源更能满足小球藻生长的需求[18].本研究培养基中含有机和无机碳、氮源，在无菌条件下培养的最终藻细胞浓度可达到亿级每毫升，高于已有报道[1，15]，进一步证明了混合培养有利于小球藻生长.已有关于小球藻培养基优化的研究均是在无菌条件下进行，培养基需要灭菌，生产需要特殊的设备，不利于推广应用.本研究不仅在无菌条件下对培养基进行了优化，而且在开放条件下对无菌优化的配方进行了改良，在其他成分不变的情况下，葡萄糖质量浓度降为0.3 g/L，利用自然光照，常温培养3～5 d，藻细胞浓度也达到了千万级，且不需要特殊设备.

微生物原位修复脱氮相对于其他生物修复技术具有见效快、成本低等优点，而单细胞藻类由于自身能利用无机氮源作为生长繁殖的物质，且能高密度培养，是污水处理脱氮常用的微生物资源.刘娥等[19]固定化小球藻7 d 可将养殖废水中10 mg/L 的氨氮降至本研究中的小球藻藻株对氨氮和硝酸盐氮的去除率也较高，分别为71%～81%和61.4%～85.6%，说明该藻株可用于有机质含量丰富、氮浓度高的污水脱氮.