基于流式细胞术的淋巴细胞亚群分类试验条件比较

姜华，文海若，刘丽，颜玉静，霍艳

基于流式细胞术的淋巴细胞亚群分类试验条件比较

姜华*，文海若*，刘丽，颜玉静，霍艳

100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室

比较不同抗体稀释度和多聚甲醛浓度对流式细胞术测定淋巴细胞亚群分类结果的影响。

取猴抗凝全血经浓度为 1% 或 4% 的多聚甲醛固定后连续4 d 上机测定淋巴细胞荧光强度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。取猴抗凝全血 50 μl 分别与1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗体混合后连续 7 d 上机测定 CD4+和 CD8+荧光强度及 CD4+与 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。

经 1% 多聚甲醛固定至第 4 天检测雄性动物 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率和雌性动物 CD8+百分率与样本制备当天相比存在显著性差异（< 0.05，< 0.01），且存在时间依赖性。样本保存至第 4 天时以 1% 多聚甲醛保存的样本 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率与 4% 多聚甲醛保存的样本相比亦存在显著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。50 μl 抗凝全血中添加 1 μl 抗体时，自制备后第 4 天起CD4+平均荧光强度即显著降低（< 0.01）。所有样本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均荧光强度显著性衰减（< 0.01）。

不同多聚甲醛使用浓度、抗体用量及保存时间均对样本的状态和试验结果产生一定影响。如流式样本当天无法测定，样本可于4% 浓度的多聚甲醛中稳定保存至制备后第 4 天检测；在 50 μl 全血中应添加至少 3 μl 抗体用于检测，以保证流式细胞仪对淋巴细胞表型识别的灵敏度，检测应于样本制备后 3 天内完成。

流式细胞术； 抗体； 淋巴细胞亚群分类； 食蟹猴； 多聚甲醛

生物制品的潜在免疫毒性风险不可小觑[1]。CD28 超级激活剂 TGN1412 在临床试验中曾出现多脏器衰竭甚至昏迷的严重毒性反应[2]，受到社会广泛关注，故在非临床安全性评价阶段有必要完善免疫毒性评价。使用流式细胞术（flow cytometry，FCM）对淋巴细胞亚群，如 CD3+、CD4+、CD8+等指标进行检测，已成为生物制品安全性研究及评价中常规而重要的免疫毒性评价指标。淋巴细胞根据表面标志的不同分为 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、NK 细胞等，而 T 淋巴细胞分为辅助和杀伤细胞亚群，在 HIV 或其他免疫性疾病的诊断、预后等都起着很重要的作用[3]。FCM 被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法，其原理为表达不同表面抗原的淋巴细胞结合不同荧光抗体，被特定的激光激发后，收集不同的荧光和散射光信号对细胞进行分析计数[4]。与免疫组化检测法相比，FCM 灵敏度高且更客观，更适宜对某一指标作定量检测[5]。然而，流式样本制备过程中多种因素可能对其结果产生干扰。如抗体组合的选择[6]、抗体稀释比例、固定液多聚甲醛的浓度[7]、血样放置时间、保存温度、抗凝剂的选择[8]等。保证试验条件的一致性及可靠性，是对受试物免疫毒性作出客观评价的基石[9]，也是确保免疫毒性的评价符合药物非临床研究质量管理规范（good laboratory practice，GLP）的前提。

食蟹猴为生物技术药物临床前安全性评价常用动物模型，本研究采集食蟹猴血样比较不同浓度多聚甲醛（1% 和 4%）以及不同抗体与全血稀释浓度（1:50、3:50、5:50 和 10:50）对外周血淋巴细胞亚群分类结果的影响，以确立多聚甲醛使用浓度和全血稀释度的最优条件，为淋巴细胞亚群分类流式检测条件的优化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 普通级食蟹猴共 34 只，雌雄各半，购入时 3 ~ 4 岁，购自广西雄森灵长类实验动物养殖开发有限公司。动物生产许可证号 SCXK（桂）2011-0002 和 SCXK（桂）2016-0001。饲养于普通级动物房不锈钢笼具内，单笼饲养。动物自由饮水，每只动物每天定量给料和水果各 150 g，自由摄取。食蟹猴饲养于恒温（16 ~ 26 ℃）、恒湿（40% ~ 70%）的条件下，明暗周期为 12 h，每小时最低换气次数 8 次。所有研究方案均通过国家药物安全评价监测中心实验动物福利伦理委员会（IACUC）的伦理审查。

1.1.2 主要试剂和仪器 流式仪校准微球（BD CalibriteTM3-color、APC bead）、流式检测抗体FITC-CD8（Clone RPA-T8，批号：37124）、PE-CD4（Clone L200，批号：17206）、PerCP-CD3（Clone SP34-2，批号：2230514）、APC-CD20（Clone 2H7）均购自美国 BD 公司；红细胞裂解液主要成分：氯化氨（批号：20080228）、碳酸氢钾（批号：F20101109）、乙二胺四乙酸二钠（批号：20100324）和多聚甲醛（批号：20111121）购自国药集团；磷酸盐缓冲液（批号：AD2016267、AD22391274）购自美国 Hyclone 公司；多聚甲醛使用前经 PBS 稀释为 1% 或 4% 的应用液。

FACSCalibur 流式细胞仪和分析软件 Cell QuestTM为美国 BD 公司产品；H-500FRS 高速离心机为日本Kokusan 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 流式样本制备方法 将CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗体组合与 50 μl 抗凝全血加入流式管中，混匀样本后于室温、避光条件下孵育 30 min。在流式管中分别加入 1 ml 的红细胞裂解液并混匀，红细胞充分裂解后，以 200 ×离心 5 min，弃上清并加入 1 ml PBS，之后再次以 200 ×离心 5 min 弃上清。当日样本在采集后4 h 之内完成制备。

1.2.2 比较不同浓度多聚甲醛对结果的影响 取 24 只猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分别与 5 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗体混合，每组平行设置空白对照。流式样本制备方法同 1.2.1，样本分别经浓度为 1% 或 4% 的多聚甲醛溶液固定，制备后于 2 ~ 8 ℃保存。连续4 d 上机测定淋巴细胞荧光强度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。

1.2.3 比较不同体积抗体与全血混合后对结果的影响 取 10 只食蟹猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分别与 1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗体混合，每组平行设置同型对照。流式样本制备方法同 1.2.1，样本使用浓度为 1% 的多聚甲醛溶液固定，制备后于 2 ~ 8 ℃保存。连续 7 d 上机测定 T 淋巴细胞 CD4+和 CD8+荧光强度及 CD4+与 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。不同样本抗原表达的荧光强度经标准化处理，得出平均荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）后再进行比较。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 多聚甲醛浓度对淋巴细胞亚群分类结果的影响

多聚甲醛主要用于固定保存细胞的原有组织形态，通常使用浓度为 1%，其高浓度通常使用 4%。样本经浓度为1% 或 4% 的多聚甲醛固定后，分别在制备后连续 4 d 测定其 CD3+%、CD4+%、CD8+%、CD4+/CD8+及 CD3-CD20+%。样本经 1% 多聚甲醛固定至第 4 天检测可见雄性动物 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 和雌性动物 CD8+% 数值与样本制备当天的相应数值相比存在显著性差异（表1，< 0.05，< 0.01），且变化存在时间依赖性。而以 4% 多聚甲醛固定的样本制备后连续 4 d 各项检测指标与制备当天相比均未见显著性变化。此外，样本保存至第 4 天时以 1% 多聚甲醛保存的样本 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 数值与 4% 多聚甲醛保存的样本相比亦存在显著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。上述结果提示多聚甲醛浓度对检测结果存在一定影响：1% 多聚甲醛固定样本最多可保存 3 d 进行检测，而多聚甲醛浓度为 4% 时在样本制备后 4 d 使用流式计数对不同表面抗原淋巴细胞作分选，仍可获得稳定数值。

表 1 样本经 1% 或 4% 多聚甲醛保存不同天数后对结果的影响（）

注：与第 1 天的结果进行比较，*< 0.05，**< 0.01；与相同组别经 1% 多聚甲醛固定样本数据比较，#< 0.05，##< 0.01，###< 0.001。

Notes: Comparing with the data on the first day,*< 0.05,**< 0.01; Comparing with samples of the group fixed with 1% paraformaldehyde,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001.

表 2 全血中添加不同量抗体测定食蟹猴淋巴细胞亚群结果（）

注：与相同检测时长稀释比例为 10:50 的相应指标比较，**< 0.01，***< 0.001；与不同检测时间相同稀释比例指标比较，##< 0.01。

Notes: Comparing with samples using antibodies diluted in 10:50 and tested at the same time point,**< 0.01,***< 0.001; Comparing with samples at the same antibodies dilutions but tested at different time points,##< 0.01.

2.2 不同抗体稀释比例对淋巴细胞亚群分类结果的影响

使用流式法作淋巴细胞亚群分类计数时，建议于 50 μl 抗凝全血中添加 10 μl 抗体。本研究分别比较在 50 μl 抗凝全血中添加 10、5、3 和 1 μl 抗体对CD4+及 CD8+平均荧光强度的影响，从而判断抗体稀释浓度差异是否对检测的灵敏度产生影响。样本经 1% 的多聚甲醛固定后连续 7 d 使用流式细胞仪检测（表 2），自制备第4天起，50 μl 抗凝全血中添加1 μl 的全血样本CD4+平均荧光强度与当天制备的添加 10 μl 抗体的全血的样本相比存在显著性差异（< 0.01，< 0.001）。此外，所有样本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均荧光强度出现显著衰减（< 0.01），抗体用量越少，衰减程度越高。上述结果提示为保证试验结果的可靠性，50 μl 全血中至少应添加 3 μl 抗体用于流式检测，样本制备后应于 3 d 内完成检测。

样本经不同稀释比例的抗体处理后，分别在处理当天及处理后2 ~ 7 d 测定其CD4+%、CD8+%和 CD4+/CD8+比值（表 3）。不同稀释比例的抗体保存不同时间后上述指标的测定结果未见显著性差异。

3 讨论

免疫系统涉及多个器官，包括胚胎器官、胸腺、淋巴结、脾、骨髓等，在发育过程中呈终生不断更新的状态，故对生物技术药的免疫毒性进行评价是重点也是难点[9]。非人灵长动物的生物学特征与人类最为接近，尤其是各项免疫系统指标与人体数据的可比性最强，成为生物技术药物临床前安全性评价的重要实验动物[10]。取动物外周血对其淋巴细胞亚群分类计数，从而对动物免疫细胞的形态特征进行动态监控并对免疫功能做出评价，已成为常规而必备的免疫毒性评价指标。尤其是 T 细胞淋巴亚群，对药物的早期药效或毒性有提示作用，其在安评领域中的应用愈发受到重视。然而多种因素均可对流式细胞计数结果产生影响，从而影响结果的稳定性和可靠性。如不同厂家及型号流式细胞仪和动物来源均可能对淋巴细胞亚群分析产生影响[11-14]。此外，不同抗凝剂及用量[8]、样本放置时间[15]及温度等因素，可能对检测的灵敏度、表面抗原破坏程度或荧光衰减程度产生影响。屈雪琪等[8]分别在样本制备后 1 ~ 10 d 内使用 FCM 测定经肝素、EDTA 和枸橼酸钠抗凝的样本的 CD3+、CD4+及 CD8+数值后发现，三种抗凝剂中肝素的抗凝效果最优，应于样本制备后4 d 内完成检测。

本研究发现不同多聚甲醛使用浓度、抗体用量及保存时间均对样本的状态和试验结果产生一定影响。多聚甲醛是最常用的组织样本固定液，甲醛可促使蛋白质的氨基之间交联形成羧甲基，固定抗原决定簇的三维构象，从而发挥固定细胞表面蛋白的作用[16]。因甲醛可经氧化变为甲酸，从而酸化样本影响染色效果[17]，故样本制备后应尽快检测。结果显示，虽然 1% 和 4% 的多聚甲醛在检测当天的效果相当，但流式样本当天无法测定，可适当提高多聚甲醛浓度。样本可于4% 浓度的多聚甲醛中在4 ℃条件下保存至制备后第 4 天检测，其固定效果较 1% 浓度的多聚甲醛更为稳定。此外，本研究数据提示样本制备时，在 50 μl 全血中应添加至少 3 μl 抗体用于检测，以保证流式细胞仪对淋巴细胞表型识别的灵敏度，检测应于样本制备后 3 d 内完成。流式检测抗体用量尚存争议，建议实际工作中使用说明书中抗体推荐量。本研究对正常食蟹猴的淋巴细胞表型检测结果进行对比研究，因不存在外源性毒性引起的免疫毒性，动物样本中淋巴细胞数量较多，荧光抗体标记分类明显；当样本中淋巴细胞含量较低时，则应慎重降低抗体使用量。本研究使用抗体-荧光素组合为 PE-CD4+/FITC-CD8+，PE 为流式细胞仪较强通道（激光器激发光和发射光波长分别为 480 nm 和 578 nm）[18]，而 CD4+为强表达抗原，两者结合使用进一步强化 CD4+信号，本研究条件下发现 PE-CD4+数值对外在因素的改变较 FITC-CD8+敏感。样本经 1% 多聚甲醛固定后，抗体稀释度对样本的荧光强度影响较大。保存时间过久或抗体稀释度过低，可影响抗体与细胞表面抗原的结合度，进而对荧光强度产生影响，故建议所有样本尽量于制备当天测定。

表 3 使用不同比例稀释抗体测定食蟹猴 T 淋巴细胞亚群结果（）

综上所述，试验条件、实验室操作技术及操作程序等多种环节均可对淋巴细胞亚群分类结果产生影响，为保证获得科学而有效的研究数据，有必要在 GLP 工作中不断积累经验，完善样本制备的过程，并严格控制仪器条件设置及测定时间等流程，尽量减少各种对于流式测定结果的影响[6,18]。本研究为不同淋巴细胞亚群分类流式检测条件的可信度提供数据支持。

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Comparison of lymphocyte subsets classification assay conditions based on flow cytometry

JIANG Hua, WEN Hai-ruo, LIU Li, YAN Yu-jing, HUO Yan

Author Affiliation: Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safety Evaluation Research of Drugs, National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China

To evaluate the effects of the dilution of antibody and the concentration of paraformaldehyde on the classification results of lymphocyte subsets detected by flow cytometry.

50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and fixed with 1% and 4% paraformaldehyde, and then the fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD3+, CD4+, CD8+and CD20+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for four days. 50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and mixed with 1, 3, 5 and 10 μl CD8+-FITC, CD4+-PE, CD3+-PerCP antibody respectively, and then the CD4+and CD8+fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD4+and CD8+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for seven days.

The detection results of the fourth day after preparation of the samples fixed with 1% paraformaldehyde showed that, the percentage of CD4+%, CD8+% and CD3-CD20+% cells from the male animals, and the percentage of CD8+% cells of the female animals were significantly different from that on the day of sample preparation (< 0.05 and< 0.01, respectively) with time-dependent effect. CD4+%, CD8+%, CD3-CD20+% cells in the samples stored in 1% paraformaldehyde on the fourth day were significantly lower than that in the samples stored in 4% paraformaldehyde (< 0.05 and< 0.001, respectively) as well. When 1 μl antibody was added to 50 μl anticoagulated whole blood, the median fluorescence intensity of CD4+was significantly lower than that on the date of preparation (< 0.01). From the fourth day, the median fluorescence intensities of CD4+and CD8+was significantly attenuated (< 0.01).

The antibody dilution and the concentration of paraformaldehyde determine the state of the sample and the detection results. If the samples could not be detected on the day of preparation, it should be stably stored in 4% concentration of paraformaldehyde at 4 ℃ until the fourth day after preparation. When the antibody dilution was no less than 3:50, the sensitivity of lymphocyte recognition to the cell phenotype could be ensured, and the detection should be completed within 3 days after preparation.

Flow cytometry; Antibody; Lmphocytes subsets; Cynomolgus monkeys; Paraformaldehyde

HUO Yan, Email: yanhuo@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.003

“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09501007-004、2018ZX09201-017）；国家重点研发计划（2016YFA0101503）

霍艳，Email：yanhuo@nifdc.org.cn

2019-07-11

*同为第一作者