艾灸督脉组穴对血管性痴呆大鼠学习记忆能力和RAGE、LRP-1表达的影响

王婧吉，吴生兵，王 堃，杨 超，程红亮

(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；3.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指因脑血管病变造成脑组织血流运行障碍，引起记忆、认知和行为改变的脑区低灌注性血管疾病，是一种慢性进行性疾病，表现为严重的认知功能障碍综合征[1]。目前VD被认为是唯一可以防治的痴呆类型，但发病机制尚不十分明确[2]。有研究认为VD和阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)有着共同的脑血管内皮损伤机制以及有神经毒性的β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在脑血管和脑实质中积蓄[3]。Aβ跨血脑屏障的转运主要通过存在于脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)膜上晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)和低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(low density lipopro-tein-receptor related protein-1，LRP-1)受体系统完成，其中LRP-1介导Aβ转运出脑，而RAGE介导Aβ转运入脑[4]。既往学者研究发现，艾灸可改善和延缓VD患者临床症状，调控与学习记忆相关神经肽物质，促进血管新生，调节神经营养因子表达[5-7]。本研究观察艾灸督脉组穴对VD大鼠BMECs的RAGE和LRP-1表达的影响，探讨艾灸督脉组穴治疗VD的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物与分组 SPF级健康雄性SD大鼠，由安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。室温为20～25 ℃，相对湿度为40%～75%，昼夜明暗交替。适应性饲养1周后，进行Morris水迷宫筛选实验，训练过程中对反应过于敏感或迟钝的大鼠予以筛除。选择性格活泼及水迷宫实验数据相近者36只，采用随机数字表法将其分为正常组、模型组和艾灸组各12只。实验手术中死亡大鼠未列入实验分析对象。实验过程中对动物的处置遵循中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂及仪器 清艾条(规格：8 mm×15 mm)：南阳艾灸厂；LRP-1抗体：美国Santa Cruz；RAGE抗体：英国Abcam；通用型二步法检测试剂盒、DAB显色剂、PBS、EDTA修复液：北京中杉；苏木素：珠海贝索；Morris水迷宫：安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司；切片机(Leica 2135)：德国；显微镜(Nikon 80i)：日本。

2 方法

2.1 模型复制方法与模型评价 模型组和艾灸组大鼠采用颈总动脉结扎反复缺血再灌注法复制模型(经典的VD模型制备方法)，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，无菌操作，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，并套以4号丝线备用，拉紧丝线扣，阻断血流20 min，同时尾部放血0.3 mL，热凝止血，松开丝线扣，恢复血流10 min，再次阻断血流20 min，如此重复3次，第3次血流在灌注后30 min，如呼吸、心跳正常，即可缝合皮肤。在模型复制完成后第4天进行行为学评分，以鉴定模型复制是否成功。若模型复制后大鼠逃避潜伏期较模型复制前显著延长(P<0.05)，则表明模型复制成功。

2.2 治疗方法 模型复制成功后，将艾灸组大鼠固定于鼠板上，并固定头部，根据《实验针灸学》[8]取“百会”“风府”“大椎”，采用清艾条悬于穴位上方约2 cm，每次每穴灸30 min，每日1次，共治疗4周。正常组和模型组：与艾灸组平行，只做鼠板上固定，不做其他任何处理。

2.3 行为学检测方法 治疗结束后，用Morris水迷宫法对3组大鼠进行行为学检测。池壁标明的4个等距入水点将水池等分为4个象限，在任一象限中央(与池壁、圆心距离相等)放置目标平台，平台低于水平面1 cm。保持实验室温度在24～25 ℃，水温在22 ℃左右。

定位航行实验：治疗结束后第1天练习站台，第2～5天将平台置于第1象限，从池壁4个起始点的任一点将大鼠面向池壁放入水池，记录其在2 min内找到并爬上平台的时间及逃避潜伏期，如大鼠在2 min内未发现平台，则用工具将其引导至平台上，停留10 s后，放回笼中，其逃避潜伏期按120 s计算。

空间探索实验：治疗结束后第6天，在定位航行实验结束后撤除平台，在各个象限相同入水点将大鼠放入池中，记录大鼠在120 s内穿越目标象限平台的次数。

2.4 免疫组织化学法测定大鼠皮质和海马RAGE、LRP-1表达水平 Morris水迷宫测试完毕后，大鼠禁食12 h，每组动物麻醉后经左心室行主动脉插管，多聚甲醛固定，断头取脑。脑组织制成4～6 μm的石蜡切片备用。切片梯度脱水，PBS洗3次后进行微波修复；冷却至室温后，PBS洗3次，血清室温封闭20 min；加一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，滴加通用型两步法二抗，室温孵育30 min；PBS洗3次后DAB显色，光镜下观察显色情况；苏木素轻度复染核3～5 min，自来水浸泡冲洗，盐酸-乙醇分色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张切片任选5个视野，以细胞胞浆或胞质、胞核中出现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应。分别测定皮质和海马组织中神经细胞及微血管上RAGE、LRP-1表达水平。

3 结果

3.1 3组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数比较 各时间点模型组逃避潜伏期均较正常组明显延长(P<0.05)，艾灸组逃避潜伏期均较模型组明显缩短(P<0.05)。见图1。模型组大鼠穿越平台次数明显少于正常组(P<0.05)，艾灸组大鼠穿越平台次数明显多于模型组(P<0.05)。见图2。

3.2 3组大鼠海马和皮质组织中RAGE、LRP-1表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠海马和皮质中RAGE表达增多，LRP-1表达减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠海马和皮质中RAGE表达减少，LRP-1表达增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4、图5。

3.3 RAGE、LRP-1表达与穿越平台次数相关性分析 结果显示，大鼠穿越平台次数与海马和皮质内RAGE存在显著负相关关系(海马：r=-0.81，P<0.05；皮质：r=-0.72，P<0.05)。大鼠穿越平台次数与海马和皮质内LRP-1存在显著正相关关系(海马：r=0.79，P<0.05；皮质：r=0.72，P<0.05)。

4 讨论

血管性危险因素是导致VD的主要因素。流行病学研究表明，高血压、心脏病、糖尿病和高脂血症等血管危险因素均可能引发VD[9]。Hardy J等[10]研究发现，脑低血流灌注、血管壁退化、神经血管炎症反应等因素可导致脑微环境异常，血脑屏障功能失调，从而影响Aβ的跨膜转运。因此，Aβ不仅存在于AD患者脑内，而且与VD也关系密切。

BMECs是指参与实现血脑屏障选择性屏障功能的血管内皮细胞，并参与血管神经单元的组成[11-12]。多项研究表明，Aβ的跨血脑屏障转运与BMECs膜上RAGE和LRP-1受体密切相关，RAGE表达的增多和LRP-1表达减少均会导致Aβ在脑内的沉积[13-15]。国内也有学者围绕调节RAGE和LRP-1表达开展治疗AD的机制研究。如周忠光等[16]研究发现，“益肾调督”针灸可通过下调AD小鼠海马RAGE表达，减少脑组织中Aβ含量，提高其学习记忆能力。胡华等[17]观察发现，复方丹参片可促进LRP-1的表达、抑制RAGE表达，从而对APP/PS1小鼠脑内神经细胞起到保护作用。基于RAGE和LRP-1表达与BMECs的分泌功能密切相关，也有学者开展血管因素引起的认知功能障碍研究。乔晋等[18]研究发现，自发性高血压大鼠RAGE mRNA及其蛋白表达水平异常增高，提示Aβ代谢异常可能参与高血压认知损害的发生。么晓轶等[19]研究发现，脑缺血再灌注后缺血脑组织糖基化终产物及其受体的表达升高。综上所述，RAGE和LRP-1的水平能够直接影响脑内Aβ的含量，从而影响认知功能。

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：与正常组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

图3 各组大鼠海马和皮质RAGE、LRP-1表达水平比较(免疫组织化学染色，10×40倍)

注：正常组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

注：与正常组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

VD属于“痴呆”范畴，古代医家从经络腧穴方面对本病积累了丰富全面的认识，历代中医文献中均有“头为诸阳之会”，督脉“入属于脑”“入络脑”“入脑”等记载，认为督脉为阳脉之海，是十二经脉之纲领及动力，与脑有着密切联系。本研究选取的穴位为百会、大椎、风府。百会为督脉经穴，是膀胱经与督脉的交会穴，膀胱经通过此穴“入络脑”；大椎穴为“诸阳之会”，具有“通调头部气血”之功；风府可“醒脑调神”，三穴共奏化瘀通络、填髓益智之功。

本研究发现，艾灸督脉组穴治疗后大鼠皮质和海马RAGE表达水平较模型组明显降低，而LRP-1表达水平则显著升高，且大鼠学习记忆能力也有所改善，说明艾灸可能通过调节RAGE和LRP-1的平衡状态起到改善VD认知功能的作用。该研究结果与临床研究结果具有一致性，为临床应用艾灸疗法参与治疗血管性认知功能提供了理论依据。