樱桃缓慢生长保存及遗传稳定性检测

(1.贵阳学院生物与环境工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵阳市农业试验中心，贵州 贵阳 550003)

赫章樱桃(Prunuspseudocerasus‘Hezhang’)是贵州重要的樱桃种质资源，具有可溶性固形物含量高、产量高及口感好等优点，是遗传育种的重要资源。但目前，田间植株疑似有病毒感染，且资源破坏变得越来越严重，因此，需要建立有效的方法进行资源保存。资源保存的传统方法是田间保存，需要大量的土地、劳力及财力投入，且容易遭受病虫害、动物及自然灾害的破坏[1]。离体保存的确是资源保存的安全方法，能避免传统方法的不足之处，亦是良种、转基因材料及突变植株保存的有效方法[2]。

离体保存分为短期保存(离体快繁)、中期保存(缓慢生长保存)和长期保存(超低温保存)。短期保持需要频繁的继代，增加了劳动力成本和体细胞无性系变异的几率，而中期保存和长期保存后能克服这些问题，但超低温保存不仅技术要求高，且需要持续消耗液氮，这限制了其应用[1,3]。然而，中期保存操作相对简单易行，只需要常规组培室或培养箱即可进行[4]，且能通过再生培养快速获得大量植株，避免田间植株供应不足的情况[5]。中期保存常通过降低培养温度[6-7]、增加渗透调节剂[8]、增加生长抑制剂或减少植物生长调节剂[4,9]，以及多种方法综合应用达到培养的目的。如今，许多植物已实现中期保存(缓慢生长保存)，包括半夏[10]、百合[11]、苹果[12-13]、马铃薯[14]、鬼臼[15]、葡萄[16-17]等。尽管许多学者探讨了樱桃的离体快繁方法[18-26]，但有关缓慢生长保存的报道却很少，目前能查阅的仅知Janeiro等[27]将野樱桃在2 ℃下保存了1年，却未见有关中国樱桃的报道。

鉴于樱桃种质资源的重要性，本文采用赫章樱桃组培苗的茎尖繁殖单芽姊妹系进行缓慢生长保存，同时采用ISSR标记检测组培苗的遗传稳定性，以期为樱桃资源保存提供更多参考方法。

1 材料及方法

1.1 缓慢生长保存

2009年6月至2010年12月以贵州省赫章县的樱桃种质组培苗为材料，在MS + 2.0 mg·L-1BA + 0.5 mg·L-1IBA + 30 g·L-1蔗糖 + 0.7%琼脂培养基上培养60 d后继代，以此建立单芽姊妹系，2010年12月底选取1.0～1.5 cm高的植株用于缓慢生长保存，保存至2011年8月，培养温度25 ℃。缓慢生长保存设置以下培养基：1)矿质元素影响。以MS、1/2 MS和1/4 MS为基础培养基，均添加2%蔗糖(表1)，培养温度为6 ℃。2)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和温度的影响。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA+20 g·L-1蔗糖 + 40 g·L-1甘露醇 + 0.7%琼脂为基础培养基，分别添加0、400 mg·L-1PVP后置于6 ℃和25 ℃培养(表1)。3)蔗糖和ABA(脱落酸)的影响。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA + 400 mg·L-1PVP + 0.7%琼脂为基础培养基，分别添加0%、2%、4%及6%蔗糖或0，1，2 mg·L-1和3 mg·L-1ABA后置于25 ℃培养(表1)。4)甘露醇的影响。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 400 mg·L-1PVP + 0.7%琼脂为基础培养基，分别添加0%、2%、4%及6%甘露醇后置于25 ℃培养(表1)。每个处理接种5株试管苗，重复8次。

表1 各种物质对赫章樱桃缓慢生长保存的影响

注：同列相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不显著。

每个接种瓶(约250 mL)中放置50 mL培养基，然后用1层牛皮纸和1层聚乙烯膜进行封口，所有培养基pH值均为5.8，经121 ℃高温灭菌20 min后用于接种，光照时间为14 h[33μmol·(m2·s)-1]。分别于培养4、6个月和8个月后统计成活率，8个月后统计增殖率及植株生长势，随后组培苗将在MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.7%琼脂培养基上进行恢复培养，30 d后统计再生率。植株生长势分为0～5级：0级为死亡；1级为褐色，部分黄化；2级为植株矮小，有淡绿色至绿色叶片；3级为植株矮小，有深绿色叶片和茎，无根；4级为植株高大，有绿色叶片和茎，无根；5级为植株高大，有深绿色叶片和茎，有根。

数据统计采用SPSS 17.0软件，成活率、增殖率用单因素方差分析差异显著性，并进行Tukey’s HSD检测，再生率采用t检测差异显著性，数据处理前进行方差齐性检测。

1.2 遗传稳定性的ISSR检测

2011年9月取各处理保存前后的组培苗数株，取其叶片分别建立各处理混合样本，采用北京天根公司生产的Plant Genomic DNA Kit(DP 305-03)试剂盒提取混合样本基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA质量及浓度，稀释至20 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列(http：//zhidao.baidu.com/question/141178305.html)，由上海生物工程技术服务有限公司合成。本实验从90条ISSR引物中筛选获得13条扩增条带清晰、多态性及稳定性好的引物用于遗传稳定性检测(表1)。PCR扩增体系为(总体积20μL)：引物1.0 mmol·L-1，DNA模板2.5 mg·μL-1，Tagmix(天根生化科技北京有限公司)10.0μL-1，甲酰胺0.5μL-1。PCR反应程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，49.1～56 ℃(温度因引物不同而异)退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶中以90 V恒定电压电泳1 h左右，DL 2000 Marker(天根生化科技北京有限公司)为标准分子量对照，紫外凝胶成像系统照相。

2 结果与分析

2.1 矿质元素、温度和PVP对试管苗保存的影响

矿质元素与植物保存有很大关系，但对樱桃成活率无显著影响，对再生率有显著影响(表2)。保存至4个月时，MS培养基上樱桃的成活率最高(80%)，6个月时急剧降至50%，8个月仅40%，而1/2 MS、1/4 MS培养基上樱桃的成活率在4个月时分别为55%、60%，但随后几乎无变化。8个月后，MS培养基上樱桃的再生率为0，而1/2 MS、1/4 MS的的再生率分别为37.5%、54.17%。在生长势上，4个月时各处理樱桃苗均矮小，叶浓绿色，无增殖；6个月后，以1/4 MS的苗最优，相对高大，叶绿至浓绿色，无根，1/2 MS的苗几乎无变化，仅有1株生根，而MS的苗为淡绿色；8个月时MS的苗为淡绿色和黄色，近死亡(图1-16)。因此，低温下，矿质元素含量较低时更利于樱桃缓慢生长保存。

表2 ISSR检测13条引物的退火温度及其扩增结果

低温是植物缓慢生长保存的重要方式，PVP是一种有效的抗氧化剂。本实验将二者进行交互处理，结果显示，培养温度对樱桃保存有显著影响(表1)。保存前6个月，6 ℃下樱桃的成活率高于25 ℃下的成活率。在4个月时，6 ℃下樱桃的成活率为100%，25 ℃下的成活率为65%；在6个月时，6、25 ℃下的成活率分别为95%、65%；在8个月时，6 ℃下的成活率急剧降至65%，但25 ℃下的成活率几乎无变化(60%)；8个月后，25 ℃下樱桃的再生率显著高于6 ℃下的再生率，分别为66.67%和12.5%。二者生长势以25 ℃下为好(图1-13、图1-14)。因此，在培养基添加物质较多的情况下，25 ℃比低温更适合樱桃缓慢生长保存。

PVP对樱桃中长期保存后的再生率有积极作用(表1)。高温下(25 ℃)，在培养初期(4个月时)，PVP对樱桃成活率有抑制作用，无PVP时为95%，而有PVP时仅为65%，但随保存时间的延长，无PVP时成活率急剧下降，6个月和8个月时分别为75%和55%，而有PVP的几乎没有变化。从生长势上看，6个月前，有PVP上的苗叶色浓于无PVP者，无增殖；8个月时，无PVP的反而为浓绿色，苗矮小，有茎较粗，增殖约4倍。但从再生率考虑，8个月后无PVP的仅为12.5%，显著低于添加PVP的(67%)。低温下(6 ℃)，PVP在培养初期(4个月时)可显著提高成活率，有PVP时樱桃成活率为100%，无PVP时仅为55%，且有PVP的一直优于无PVP的，再生率和苗生长势亦如此(图1-12、图1-14)。因此，樱桃中长期保存时添加PVP可提高再生率。

2.2 蔗糖和甘露醇对樱桃缓慢生长保存的影响

蔗糖是离体保存的重要渗透调节剂和碳源，有无蔗糖对樱桃缓慢生长有显著影响，但浓度的高低对其成活率无显著影响(表1)。保存4个月时，无蔗糖培养基上樱桃成活率仅有30%，而2%～6%蔗糖培养基上成活率为70%以上，随后均略有下降；保存到8个月时，无蔗糖培养基上樱桃已全部死亡，其余为65%及以上。再生率以2%蔗糖稍高(85.42%)，其次是4%蔗糖(80%)，最后是6%蔗糖(76.77%)。对生长势而言，无蔗糖时樱桃苗叶色淡绿或黄色，植株矮小，略有增殖；2%和4%蔗糖时苗相对高大，健壮，叶绿至浓绿色，增殖较多。在4个月时，2%蔗糖培养基上有多株生根；在8个月时，二者都有生根；6%蔗糖培养基上苗相对矮小，叶浓绿色，增殖较少，无根(图1-1、图1-2、图1-3)。因此，选择2%～4%的蔗糖为好。

甘露醇也是离体保存常选择的碳源，对樱桃中期保存有显著的影响(表1)。4个月时，6%甘露醇培养基上樱桃的成活率显著高于其余浓度，但6个月时降至60%，8个月时急剧降至35%，其余几乎保持不变。无甘露醇时再生率为85.42%，2%甘露醇时为83.33%，显著高于4%甘露醇(67%)和6%甘露醇(0)时。由图1-4、图1-5、图1-6可见，在生长势上，无甘露醇时苗相对高大健壮，叶绿至浓绿色，增殖多，有生根；2%和4%甘露醇时相对较矮，叶浓绿色，增殖少，无根，而6%甘露醇时更矮，叶淡绿至绿色，增殖少，且有玻璃化现象；4%蔗糖培养基与2%蔗糖+2%甘露醇培养基上的苗相比，生长势更好。因此，甘露醇以不超过2%为宜。

2.3 ABA对樱桃缓慢生长保存的影响

适当添加ABA对樱桃中期保存有积极作用(表1)。

注：1～3是添加2%、4%和6%蔗糖植株；4～6是添加2%、4%和6%甘露醇植株；7～10是添加1、2 mg·L-1 和3 mg·L-1ABA植株(9和10是添加3 mg·L-1 ABA植株)；11是添加3%甘油植株(数据未列出)；12是添加400 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；13是添加0 mg·L-1 PVP于25 ℃保存的植株；14是添加0 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；15～17是在1/2 MS、MS和1/4 MS上保存的植株。图1 赫章樱桃缓慢生长保存8个月后的植株

注：泳道M为分子量标记，1～16泳道分别代表以下处理的单芽姊妹系植株：1是保存前；2～4是添加2%、4%和6%蔗糖植株；5～7是添加2%、4%和6%甘露醇植株；8～10是添加1、2 mg·L-1和或3 mg·L-1 ABA植株；11是添加400 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；12是添加0 mg·L-1 PVP于25 ℃保存的植株；13是添加0 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；14～16是在1/2 MS、MS和1/4 MS上保存的植株。图2 缓慢生长保存的遗传稳定性

在4个月时，无ABA培养基上樱桃的苗成活率仅30%，而添加ABA后，苗成活率除3 mg·L-1ABA为40%外，其余为80%以上；在6个月时，1 mg·L-1及4 mg·L-1ABA上苗成活率急剧降至60%，而2 mg·L-1ABA上为80%；8个月时，1 mg·L-1及4 mg·L-1ABA培养基上樱桃的苗成活率进一步降至35%和45%，而2 mg·L-1ABA培养基上苗成活率为70%。尽管2 mg·L-1ABA培养基上的苗成活率显著高于1 mg·L-1ABA上的，但其再生率却显著低于1、4 mg·L-1培养基上的。从生长势上看(图1-7、图1-8、图1-9、图1-10)，无ABA的苗矮小，叶淡绿色，部分黄色，而有ABA的苗均高大，叶淡绿至绿色，叶片宽大，冠幅大，增殖极少，无根。因此，适量的ABA可以延长樱桃保存。

2.4 遗传稳定性检测

图2为赫章樱桃缓慢生长保存中的ISSR检测电泳图(引物815)，由图2可见，保存前后的15个处理中，13条ISSR引物共获得97个位点，未发现特异条带，平均每条引物获得7.5个位点。使用目前的中期保存办法，经过240 d的培养并未检测到体细胞无性系变异。

3 讨 论

本试验结果发现，低温下矿质元素含量较低时更利于樱桃缓慢生长保存。原因可能是低温下植物新陈代谢变慢，因为低温下细胞膜积累了不饱和脂肪酸，后者使细胞膜变薄并阻止细胞分裂和伸长[28-29]。Kotuby等[30]认为樱桃对盐敏感。低温下，如果培养基中有较多的矿质元素，也许起初植物能吸收并利用，但随着时间延长，新陈代谢的减弱，植物体内会积累过多的矿质元素，从而形成毒害。因此，我们认为1/4 MS和1/2 MS比MS更适合樱桃在低温下进行保存。雪松茎尖保存时，也以1/2 MS和1/4 MS为好[31]。苹果在低温下以1/4 MS为好[13]。低温培养是一种植物缓慢生长保存的主要方式，且有效应用于多种果树[12,32-35]，本研究发现，无论培养基中有无PVP，樱桃在25 ℃下比6 ℃下表现更好，特别是苗生长势和再生率。可能此时培养基有很多营养物质，低温不利于樱桃保存，原因与上述一致。Janeiro等发现，野樱桃低温冷藏时间越长，增殖能力越低[27]。El-Ashry等发现，低温不利于2种枣椰树的中期保存[6]。同时，Watt等认为，低营养水平的培养基并不适合甘蔗的中长期保存[36]。也许其他方式更适合樱桃缓慢生长保存，比如PVP便能增加组培苗再生率，渗透调节剂的浓度和种类对植物保存尤为重要。

合适渗透调节剂种类和浓度将大大提高保存效果，蔗糖为首选物质，其次是甘露醇[37]。本实验发现，2%～4%的蔗糖对樱桃缓慢生长保存更好，而非6%蔗糖。高浓度的蔗糖并不利于小豆中期保存[38]。Neveen等将葡萄缓慢生长保存1年，2%和6%的蔗糖分别获得66.66%和33.33%成活率[16]。Pan等也发现，6%蔗糖培养基上的葡萄培养8个月便全部死亡[17]。但本实验保存8个月时，4%和6%蔗糖上的植株仍有约70%的成活率，也许樱桃比葡萄更能适应高浓度蔗糖，原因可能是不同的植物对水分需求不一样所致，樱桃更耐旱。几乎已有报道均认为植物更适合低浓度的蔗糖，Shibli等认为，原因可能是蔗糖主要是作为碳源，而非渗透调节剂[37]，笔者认为也许高浓度的蔗糖使培养基渗透式升高，使得植株不能吸收足够水分以供生长。甘露醇虽然是一种可用的渗透调节剂，但本实验发现，超过2%的甘露醇便不利于樱桃缓慢生长保存，且完全使用蔗糖比蔗糖和甘露醇混合使用效果更好。鬼臼缓慢生长保存加入蔗糖和甘露醇后植株黄化，二者单独或混合使用浓度到4%时，成活率及再生率均下降，并认为甘露醇对植株有毒害性[15]。虽然甘露醇能抑制植株生长，但多种苹果保存显示甘露醇单独使用不利于缓慢生长保存，保存时间仅约3个月[13,39]。狭叶香[9]和番红花[40]缓慢生长保存时也不适应高浓度甘露醇，植株高度随着浓度升高而降低。Neto和Otoni认为，甘露醇含量的增加引起植株碳水化合物毒害或渗透压过高[41]。

ABA是一种生长抑制剂，本实验发现，添加少量的ABA有利于樱桃缓慢生长保存，尤其是使组培苗增高，但其他效果并不理想。Kovalchuk等也认为，部分苹果种质缓慢生长保存时无ABA更好[13]。培养基添加0.5 mg·L-1ABA培养基上保存1年的白草蒿可再生，但2.0 mg·L-1ABA时不能再生[8]。狭叶香再生率随ABA浓度升高而急剧下降[9]。树胡椒组培苗的各项指标都随ABA浓度的升高而下降[42]。徐志微等也认为ABA 不适于离体保存巨玫瑰、黑玫瑰葡萄组培苗[43]。同时，Renau等认为ABA会引起雪松缓慢生长保存中的甲基化[31]。王爱华等也发现，在2.0 mg·L-1ABA上保存半夏出现了1条新增标记和1条缺失标记，个体变异率为30%[10]。因此，不建议在樱桃缓慢生长保存时添加ABA，但若需要创造新资源，使用ABA进行保存也许是一个方法。同时，本试验过程中发现，所有添加甘油的培养基上的植株均死亡，说明甘油不能用于樱桃中期保存。