生物周期节律紊乱大鼠乳腺组织的蛋白质组学研究*

崔博舒, 衣同辉, 郎尉雅, 刘惠铭, 刘洪羽, 王杨, 李正, 纪怡然△, 潘洪明△

1佳木斯大学基础医学院(黑龙江佳木斯154007)； 2齐齐哈尔医学院基础医学院(黑龙江齐齐哈尔161006)； 3齐齐哈尔市第一医院病理科(黑龙江齐齐哈尔 161005)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在世界范围内明显上升[1]。研究表明乳腺癌是多种因素共同作用所致的复杂生物学过程，与遗传、环境、心理等诸多因素相关[2-3]。多项研究发现长期从事夜班工作的女性患乳腺癌的风险明显增高[4-6]，提示生物周期节律紊乱可能是乳腺癌发生发展的重要危险因素，然而其机制尚不完全清楚。昼夜节律是生物周期节律中受光照影响最大的一种节律性行为，包括睡眠、代谢、激素分泌、细胞增殖及凋亡等[7-9]多种生物行为及生理过程都存在着昼夜节律现象。近年来，生物周期节律紊乱在包括乳腺癌在内的疾病发生、发展过程中的作用已成为生命科学研究热点之一，但其对乳腺组织及其信号通路网络的影响未见报道。本研究的2017年1月至2018年1月，本实验以大鼠的乳腺组织为样本，采用高通量蛋白质组学技术，研究生物周期紊乱模型大鼠乳腺组织中蛋白质表达的影响，并对肿瘤相关信号通路蛋白进行分析，探讨生物周期节律紊乱与乳腺癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 制备生物周期节律紊乱动物模型及指标评价

1.1.1 制备生物周期节律紊乱动物模型 选用筛选合格的40只雌性SD大鼠，使用36W普通家庭采用的日光灯作为实验室光源，模拟大多数人作息的时间。按照随机的方法分为生物周期节律紊乱实验组和对照组。两组实验动物均在实验室中自然光照条件下饲养1周，以适应实验室条件。从第2周开始，对照组大鼠接受6:00—18:00光照/18:00—6:00黑暗的24 h光照周期。实验组大鼠接受每天光照时间为6:00—18:00光照/18:00—6:00黑暗以及22:00—10:00光照/10:00—22:00黑暗两种光照制度，每3 d转换1次，实验期间动物自由摄水、摄食，观察并记录实验大鼠的行为变化。5周后对模型进行指标评价。

1.1.2 指标评价

1.1.2.1 血清中雌二醇(E2)含量的检测 腹主动脉取血，取动脉血2 mL，待凝固后，4℃，3 000 r/min，离心10 min后分离血清，操作步骤严格按照ELISA试剂盒上的说明进行。

1.1.2.2 荧光定量PCR 对两组大鼠的下丘脑组织进行取材，在液氮中速冻。采用Trion法提取RNA，按照Takara 公司The Prime Script First strand cDNA Synthesis Kit说明书中的方法进行逆转录及PCR反应(PCR引物的合成由博士德生物公司合成)。

1.2 提取乳腺组织及应用iTRAQ蛋白标记技术进行乳腺组织蛋白质表达的研究

1.2.1 乳腺组织的取材 将大鼠麻醉，找到第4对乳头，使用钝性剪刀沿腹中线切口，用两对钳子从腹膜上把皮肤剥离下来，将皮肤翻过来，在乳头的外侧区域即可以看见乳腺组织。

1.2.2 iTRAQ定量标记蛋白质组学技术 首先，提取两组大鼠乳腺组织蛋白，并对其进行酶解及除盐，根据iTRAQ-8标试剂盒(SCIEX)说明书进行标记，将混合后的肽段运用Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo DINOEX，USA)对肽段样品进行分级分离。将多肽样品溶解于2%乙腈/0.1%甲酸中，并应用TripleTOF 5600+液质联用系统(SCIEX)进行质谱数据采集，使用与Eksigent nanoLC系统(SCIEX，USA)偶联的TripleTOF 5600plus质谱仪进行分析。其次，进行蛋白质鉴定及定量，实验组和对照组两两样品蛋白间显著差异在差异倍数≥1.5或者≤0.67倍，P值≤0.05的条件下视为差异蛋白。最终，对所有鉴定蛋白和显著性差异蛋白质进行GO、Pathway注释结果以及显著性差异蛋白的GO富集分析。

GO注释分析总共有3个本体(ontology)，分别描述基因的分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)、参与的生物过程(biological process)，该方法能够对蛋白进行分类，并研究蛋白生物过程，如细胞过程，如细胞增殖、周期、死亡和黏附等方面，代谢过程、应激过程及信号转导等多种生物过程。Pathway代谢通路注释分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。GO功能显著性富集分析给出与所有鉴定到的蛋白质背景相比，差异蛋白质中显著富集的GO功能条目，从而给出差异蛋白质与哪些生物学功能显著相关。通过这些分析试图挖掘有意义的蛋白。

2 结果

2.1 生物周期节律紊乱模型指标评价结果

2.1.1 荧光定量PCR及行为学观察的结果 经荧光定量PCR方法检测的数值得出，Bmal1的表达水平下调，其他生物钟因子的表达呈不规律性变化(表1)，生物周期紊乱可导致主要的时钟分子表达水平异常。生物周期节律紊乱组大鼠从第14天开始白天活动量增加，第30天出现脾气烦躁等异常行为表现，其自身的昼伏夜出的节律性行为消失。

表1 大鼠乳腺组织中重要生物钟基因荧光定量PCR相对表达量

*与对照组比较P<0.05

2.1.2 血清中E2含量的检测结果 实验组大鼠血清中E2的含量为(132.8±8.7)pg/mL，对照组为(125.95±0.9)pg/mL，与对照组比较，实验组的大鼠血清中E2的含量有显著升高(P<0.05)。结合荧光定量PCR中所测得下丘脑组织中生物钟基因表达量的变化以及实验大鼠行为学改变，表明生物周期紊乱大鼠动物模型制备成功。

2.2 iTRAQ定量标记蛋白质组学结果

2.2.1 蛋白质鉴定结果 本次实验中，质谱产生的二级谱图数、解析的二级谱图数分别为273 211、57 346，鉴定到肽段数和蛋白数目为9 731和1 716，其中至少含有2个unique肽段的蛋白质数目为1 264(鉴定到谱图数和肽段数的可信度至少为95%)。

2.2.2 蛋白质定量信息统计结果 本实验结果共鉴定到1 716种蛋白(按照至少包含两个独立的肽段过滤，共鉴定到1 264种蛋白)，其中1 651种蛋白在实验中有定量结果，两组中存在显著差异的蛋白数为169种(其中显著性差异蛋白质数目按照上调≥1.5或下调≤0.67，P值≤0.05进行相应的筛选)。与对照组相比较，实验组有60种蛋白表达上调，109种蛋白表达下调。

2.2.3 鉴定和差异蛋白质功能注释

2.2.3.1 GO注释分析结果 本次实验对上调和下调差异蛋白质进行独立的功能注释分析结果，可以看出上调和下调中的部分差异蛋白质，能够更加清楚地分析差异蛋白质的功能。见表2。

表2 差异蛋白质的 GO功能注释结果

2.2.3.2 Pathway代谢通路注释分析结果 Pathway代谢通路注释到S组和D组中上调和下调差异蛋白质数目排名前十的Pathway功能统计结果见表3，通过Pathway代谢通路注释分析发现Tensin1、Glutathione S transferase theta2(谷胱甘肽S转移酶2)及Glutathione S transferase pi(谷胱甘肽S转移酶pi)与癌症信号通路相关的生物分子表达量水平发生改变，Calmodulin-like5及Calmodulin-3参与褪黑激素的生成及GnRH信号通路的生物分子在周期节律紊乱组中表达水平降低，而参与Melanogenesis、GnRH、Calcium、Wnt、ErbB等多条信号通路的生物分子Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit α在周期紊乱组中表达水平增高。

表3 差异蛋白质的Pathway功能统计结果

2.2.4 差异蛋白的富集分析结果 差异蛋白质GO功能富集结果中细胞组分显著富集分析结果(top10)。见表4。

表4 差异蛋白细胞组分显著富集分析结果 n(%)

3 讨论

生物节律紊乱对肿瘤等疾病的发生发展过程的影响已经成为医学研究的新课题。体外试验检测3种体外培养的肿瘤细胞所分泌的生物钟基因Per-1、Clock水平，发现不同的癌细胞的同种生物钟基因表达水平峰值、峰谷基本一致，这揭示了肿瘤的生长可能受生物节律的调节[10]。大样本人群研究发现生物钟基因PER3基因型与乳腺癌的发病率相关联，提示生物周期节律紊乱与乳腺癌发生、发展密切相关[11]，经常从事夜班工作的女性人群患乳腺癌等与雌激素水平密切相关的恶性肿瘤的风险显著增高[11-13]，然而生物周期紊乱通过何种机制影响乳腺癌等疾病发生发展的进程有待于进一步阐明。为了探讨生物周期节律紊乱与乳腺癌等疾病发生发展的关系，本研究采用蛋白组学的方法研究生物周期节律紊乱对大鼠乳腺组织中与乳腺癌等疾病发生发展相关的信号通路蛋白表达水平进行分析，阐明生物周期节律紊乱与乳腺癌等乳腺疾病发生发展之间的关联。

应用iTRAQ蛋白标记技术、HPLC分离以及液相色谱-质谱联用方法，检测生物周期节律紊乱实验组和对照组乳腺组织的蛋白质表达水平。实验鉴定到1 716种蛋白，两组间存在差异的有169种，分析发现有54种蛋白是肿瘤相关的信号通路分子，其中Tensin1等9种蛋白的表达水平在两组间有显著差异。Tensin是可以结合到肌动蛋白微丝的黏着分子，其氨基末端能与肌动蛋白微丝相互作用[14]，在细胞外基质和细胞骨架之间进行跨膜连接，参与P53、胰岛素、代谢等信号通路，与子宫内膜癌、前列腺癌、小细胞肺癌及黑色素瘤相关。研究表明Tensin1可通过激活Cdc42调节乳腺癌细胞的侵袭和转移[15-17]。Glutathione S transferase pi(GSTP)和Glutathione S transferase theta 2(GSTT2)都属于谷胱甘肽(GSH)家族。早期研究发现GSTT2和乳腺癌治疗反馈有关[18]，GSTP在恶性肿瘤组织中高表达，但在前列腺癌中表达降低[19]。GSTP还可以通过与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路[20]。本实验研究结果发现生物周期节律紊乱上调乳腺组织中Tensin1、GSTT2表达水平，而GSTP表达水平显著下调，提示生物周期节律紊乱可以影响肿瘤相关的信号通路，进而对乳腺癌等疾病的发生发展进程产生影响。此外，乳腺癌是激素依赖性肿瘤，雌激素与乳腺癌的发生发展密切相关[21]，而褪黑激素不仅能抑制雌激素系统还能帮助调节昼夜节律。本研究发现生物周期节律紊乱可以改变乳腺组织中3种褪黑激素生成相关的蛋白表达水平。Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha参与Melanogenesis、GnRH、Calcium、Wnt、ErbB等信号通路中，在周期紊乱组中高表达。而Calmodulin-like 5及Calmodulin-3参与褪黑激素的生成及GnRH信号通路，在周期节律紊乱组中低表达。上述3种蛋白都参与褪黑激素的生产和GnRH信号通路中，提示生物周期节律紊乱可以干扰某些激素合成与分泌。

综上所述，通过对光照条件改变所致的生物周期节律紊乱对大鼠乳腺组织蛋白组学研究，对乳腺癌等疾病发生发展相关的信号通路蛋白表达水平进行分析，发现生物周期节律紊可以改变大鼠的乳腺组织蛋白质表达谱，Tensin1及Glutathione S transferase pi、Glutathione S transferase theta 2以及Calmodulin-like 5、Calmodulin-3等肿瘤和内分泌相关蛋白表达水平发生改变，提示生物周期节律紊乱可以影响多种肿瘤及内分泌相关信号通路，这也可能是生物周期紊乱人群乳腺癌等恶性肿瘤风险增高的原因。研究结果提示人们应尽量合理安排日常的作息时间，保持健康规律的生活和工作节奏，降低由于生物周期节律紊乱所致的疾病风险。在后续的研究中，将进一步研究生物周期节律紊乱影响肿瘤及免疫相关信号通路的机制，阐明生物周期节律紊乱与乳腺癌等疾病发生发展的关系。