大豆异黄酮纳米粉体的反溶剂法制备及表征

张晓南 普 楠 张潇元 吴长玲 施 珩 王中江 江连洲，3 杨秋萍，3*

（1东北农业大学 哈尔滨 150030

2黑龙江省学勤科技有限公司 哈尔滨 150030

3黑龙江省绿色食品科学研究院 哈尔滨 150028）

大豆异黄酮是黄酮类化合物的一种，是大豆生长代谢中产生的次级活性物质。大豆生长的过程伴随着大豆异黄酮的形成过程。由于大豆异黄酮的化学结构和人体雌性激素的化学结构非常相似，因此大豆异黄酮又被称为植物雌激素。有研究表明：长期定量的摄入大豆异黄酮可调节体内的雌激素含量，使其保持一个正常的范围，从而达到抗衰老的功效。服用大豆异黄酮也可以预防和治疗骨质疏松、动脉血管硬化等病症[3]。纯度高的大豆异黄酮粉末一般呈浅黄色或米白色，有苦涩味[1]。由于大豆异黄酮化学结构上具有特殊的疏水性，因此它的水溶性非常差。这直接导致大豆异黄酮原粉的生物利用度极低，严重影响人体的吸收和利用。

目前制备药物微粉的传统工艺包括气流破碎法、球磨研磨法、沉淀法以及超临界流体法等[4]。纯机械破碎的方法效率低，能耗大，污染重，生产过程中对人体健康造成危害，同时也对环境造成一定程度的污染。超临界流体法虽然污染小，但设备造价与维修费用高昂，制得的纳米颗粒收率低且不易于工业化。

反溶剂重结晶法[5-6]是制备生物活性粉体的一种重要方法，其原理是：将药物溶解后，通过调节一定的物理条件，将药物释放到其不溶解的反向溶剂中，阻止药物晶核的生长和团聚，通过干燥最终得到小粒径的纳米粉体[9-10]。用这种方法制备的纳米粉体生物利用度有较大的提高[7-8]。反溶剂重结晶技术与传统制备工艺相比具有更好的前景[11-14]，其对环境友好，工艺操作相对简便，适合工业化大规模生产。目前已有多种难溶性口服药物通过此方法提高了生物利用度[15-17]。

本试验中先采用单因素的方法进行预试验，得到初步试验结果后，再通过正交软件设计因素和水平，优化反溶剂制备过程，最终制得颗粒均匀，分散性较好且生物利用度较高的大豆异黄酮纳米粉。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

图1 大豆异黄酮的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of isoflavone

市售食品级大豆异黄酮（纯度80%），河南嘉致化工产品有限公司；二甲基亚砜（分析纯），天津天力化学试剂有限公司；丙酮（分析纯），天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器和设备

磁力搅拌机（MS-H280-Pro），Dragonlab 公司；蠕动泵（KCP-B08G），Kamoer公司；干燥箱（DHP-9052），一恒科学仪器有限公司；电子天平（BP-622B），上海奔普仪器科技有限公司；循环水真空泵（SHZ-III），上海亚荣生化仪器厂。

1.3 反溶剂重结晶

反溶剂重结晶法是制备生物活性粉体的一种常用手段，原理为：在两种体系的（溶剂与反溶剂）混合过程中，一定条件下的生物质溶液会形成过饱和度，然后经过成核、结晶、重组一系列环节组成纳米粒子。驱动这个过程的主要因素是过饱和度的程度以及形成速度，此外，在此过程中重组而形成的纳米粒子特征（形貌、晶型、粒径等）显著的依赖于产生过饱和度的程度和稳定性。

1.4 反溶剂重结晶过程

配制不同浓度的大豆异黄酮-二甲基亚砜溶液，启动反溶剂装置，装置中的真空泵产生负压将溶液通过高压喷嘴传送至无水丙酮（反溶剂溶液）中，此时均质机以1 000 r·min-1的速度在两相溶液中快速搅拌；经过充分的搅拌混合，两相溶液立刻产生大量的乳白色的絮状沉淀物，采用负压抽滤的方式收集这些反溶剂结晶，用20 mL无水丙酮洗脱结晶体上的溶剂残留3次，收集并干燥结晶体，最终得到疏松、流动性较好的纳米大豆异黄酮粉。

1.5 采用正交试验优化参数

使用latin软件对试验进行L9（34）设计，考察的因素包括：反应时间，体积比，转速和浓度，以微粉的粒径为考察指标（见表1）。

表1 影响因素及水平Table 1 Influencing factors and corresponding levels

1.6 扫描电镜（SEM）

取适量样品用双面导电胶带粘于观察台中央，置于离子溅射仪的样品舱中，15 mA的电流下喷金处理，通过扫描电镜（JSM-6360LV，JEOL，日本）观察粒子的外观形貌并计算平均尺寸。

1.7 差示量热（DSC）检测

按照李旺等[15]处理方法，对仪器温度校准后，将样品置于样品池，称重后置入仪器样品座检测分析。通氮气速率为50 mL/min，升温速率10℃/min，设定温度的范围25～300℃。

1.8 红外光谱（FT-IR）检测

本研究使用KBr作为分散剂，采用压片法制备待测固体试样。将原粉与纳米粉分别和KBr粉混合后充分研磨均匀，在低真空（3 mmHg）下用油压机加压（8 T/cm2）5 min 压片，得到厚度约为 1～2 mm的透光圆形薄片，将薄片致于红外干燥箱中干燥2 min后在4 000～400 cm-1范围内进行红外扫描分析。

1.9 数据处理

每组试验都进行3次平行试验，并将试验数据进行误差分析。采用统计学软件SPSS对试验数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析；采用Origin 9软件进行作图。

2 结果与检测

2.1 正交试验结果

正交试验以四因素三水平共9个试验建立，以 A 反应时间（min），B 体积比，C 转速（r/min），D质量浓度（mg/mL）为因素，各自确定3个水平来建立正交试验体系。试验结果以微细颗粒的粒径来体现。

通过正交试验表格可以分析出：对粒径影响程度由大到小的因素分别为A（反应时间）＞C（转速）＞D（浓度）＞B（体积比），试验结果在条件 A2，B1，C3，D3下试验结果为最佳。

表2 正交试验设计表及结果Table 2 Orthogonal experiment design and results

2.2 扫描电镜（SEM）分析

通过扫描电镜可以很好地观测纳米粒子的形貌特征和尺寸。图2a为大豆异黄酮原粉，可以看出未经制备的原粉形态不规则、粉体呈现大块状，比表面积较小、粉体粒径大小在几微米至几十微米不等，这样的粒子往往水溶性较差；而制备后的（图2b）异黄酮纳米粒子相对均匀统一、粒子的形态较为规则、呈现出圆球状，平均直径低于200 nm。粒子的平均比表面积较大，制备后的图2b纳米粉与图2a原粉相比，具有较大的比表面积。

图2 制备前后大豆异黄酮粉的扫描电镜观测结果Fig.2 SEM testing of processed and unprocessed isoflavone

2.3 DSC分析

如图3所示为DSC吸热曲线，分别检测了大豆异黄酮原粉和纳米粉的样品，原粉的吸热峰分别在104，162℃处，纳米粉的吸热峰则在88℃和147℃处出现，制备后的粉体对应的峰值小于异黄酮原粉峰值，这证实了纳米粉的熔点较原粉低，这是由于稳定型的结晶拥有更高的熔点，亚稳定型结晶的熔点变低导致。

2.4 红外光谱（FT-IR）分析

图3 制备前后大豆异黄酮粉的DSC光谱分析Fig.3 DSC spectra of processed and unprocessed isoflavone

通过FT-IR检测可知，制备前后的两种异黄酮样品的红外谱图的峰形基本一致，出峰时间也相差不大（图4），制备前、后的两种粉体有着大致相同的红外吸收峰位置，制备后的微粉峰高略大，但二者均为结晶型颗粒。这说明经过反溶剂重结晶法制得的粉体其化学结构并没有发生改变，这与胡婷婷等[18]的研究结果一致。

图4 制备前后大豆异黄酮粉的傅里叶红外光谱分析Fig.4 FT-IR spectrascopy of processed and unprocessed isoflavone

2.5 堆密度测试

通过堆密度测试比较说明：在质量相同的情况下，异黄酮纳米粉（a）的体积几乎是原粉（b）的2～3倍；制备后的异黄酮纳米粉比表面积有较大的增加，粉体变得疏松均匀，而且流动性也变得更好。质量不变但体积改变后，制备后的异黄酮密度变小，其水溶性较之前得到了极大的提高。

图5 堆密度分析制备前后的大豆异黄酮粉体Fig.5 The bulk density of processed and unprocessed isoflavone

2.6 不同试验因素对微粉粒径的影响分析

2.6.1 反应时间 随着反应时间的延长，粒径变化呈现逐渐下降的趋势。反应初期，由于奥斯瓦尔德熟化效应，小粒子在反溶剂体系下发生相互碰撞，团聚生长成为分子群和复分子群；随反应时间的延长，和搅拌体系的高速运转，粒径大小逐渐降低并趋于平衡；溶剂的析出有利于阻止小粒径的粒子团聚，最终趋于稳定[19]。

2.6.2 溶剂反溶剂体积比 由表2看出，当溶剂与反溶剂体积比达到1∶6时，得到的微粉粒径是208 nm。我们进行了补充试验（试验条件：溶剂反溶剂体积比 V（DMSO）∶V（丙酮）为 1∶7 与 1∶8，溶液初始质量浓度为300 g/L，搅拌转速为1 200 r/min），所得的大豆异黄酮的平均粒径为219 nm与250 nm，与溶剂比为1∶6条件下制得的样品粒径相近，因此选取的最佳溶剂比例为1∶6；这与刘志胜等[16]研究中所述内容相符。

2.6.3 搅拌转速在反溶剂重结晶试验体系中，搅拌速度与粒子成核大小是呈反比的。提高搅拌速率，会导致粒子在溶液内部较快运动，形成向心力，做有规律的离心运动，从而减小粒子发生碰撞的机会；这一现象有效抑制了分子群的形成，抑制了粒子粒径的生长，从而获得较小的粒径生成。因此经对比分析，文中所选取的最佳搅拌转速为1 200 r/min。

2.6.4 大豆异黄酮溶液浓度 提高溶液浓度可使反溶剂体系生成的晶核临界半径减小，提高晶核生成的速率，使晶体数量增多，生成小晶粒[15]。由表2数据可知：当原料大豆异黄酮溶液质量浓度为300 mg/mL时，得到的粒径达到最小值208 nm。在相同条件下重复试验2次，得到的粒径分别为205 nm和256 nm，因此，选取最佳大豆异黄酮溶液初始质量浓度为300 mg/mL。

图6 反应时间对样品平均粒径的影响Fig.6 Effect of precipitation time on the average particle size

图7 溶剂反溶剂体积比对样品平均粒径的影响Fig.7 Effect volume ratio of solvent on the average particle size

图8 搅拌转速对样品平均粒径的影响Fig.8 Effect of stirring speed on the average particle size

3 结论

采用反溶剂重结晶法制备的纳米大豆异黄酮粉体粒度均匀，本方法操作简便易行、试验制得的粒子形貌和尺寸易于调控，本试验结果粒径与反应时间呈正比、与溶剂-反溶剂的体积比、转速、溶液浓度呈反比，本试验最佳工艺条件为：反应时间3 min，体积比 1∶6，溶液质量浓度 300 mg/mL，反溶剂过程的搅拌转速为1 200 r/min，上述试验结果表明：反溶剂重结晶法制备纳米大豆异黄酮粉体的工艺切实可行。红外光谱结果可得知：制备前后的粒子化学结构没有变化。制备后的纳米粉流动性变得更好、粒子疏松密度减小、粒径分布均匀化且比表面积增大2～3倍。本研究结果对大豆异黄酮产业具有一定的指导作用。