乙醇适应对鼠伤寒沙门氏菌及其菌膜耐致死胁迫的影响

邓一秒 杨璐环 张晓婷 董冬丽 唐书泽

（暨南大学食品科学与工程系 广州 510632）

沙门氏菌（Salmonella）是一种导致人畜共患沙门氏菌病（Salmonellosis）发病率高的致病菌。我国人细菌类食物中毒案例中，70%～80%是由沙门氏菌引起的，沙门氏菌中毒食品中，约90%属于肉、蛋、奶动物产品[1]。探究沙门氏菌在食品生产加工环境下的污染途径和生长特性，是保障食品生物性安全和降低细菌性疾病风险的关键。

沙门氏菌因不产芽孢孢子，被认为是一种热敏、易被杀死的致病菌，因而，在食品加工生产过程中，沙门氏菌对环境的适应和抵抗特性容易被忽视。如沙门氏菌具有血清型种类繁多[2]、革兰氏阴性复杂细胞壁结构和生物菌膜等抗逆危害等特点[3]。沙门氏菌在生物和非生物表面形成的菌膜因其孢外复杂结构和孢内群体感应，大大增强了菌体对外在环境，如酸碱度、温度、渗透压、消毒剂、抗生素等的抵抗能力，从而引起食品安全问题[4-5]。

在食品加工过程中，乙醇常用作仪器设备表面的杀菌剂和消毒剂，低浓度的乙醇也被用作汉堡、酱油等产品中的防腐剂以延长产品货架期，除此之外，乙醇也广泛存在于发酵食品、饮料和果产品中并被认为发挥抑菌保鲜作用[6]。Chiou等[7]研究报道，低浓度的乙醇适应对肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌不仅没有抑制作用，相反还产生直接或间接的保护作用。这一研究结果目前只限于低含量的乙醇适应对浮游菌和无机酸的影响，缺乏乙醇适应对致病菌菌膜和有机酸影响的文献报道。

本文选取发病率高的食源性致病菌鼠伤寒沙门氏菌，以5%的乙醇作乙醇适应性试验，探究低含量乙醇适应对浮游菌和菌膜耐致死胁迫的影响以及乙醇作用方式对鼠伤寒沙门氏菌菌膜形成的影响，为有效防控鼠伤寒沙门氏菌及其菌膜危害风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028，广东环凯微生物生物科技有限公司；大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基，广东环凯微生物生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器设备

结晶紫，健阳生物科技有限公司；无菌PBS，博士德生物工程有限公司；酶标仪（Infiniti M200pro，Switzerland），帝肯贸易有限公司；偏光显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；6/96孔细胞培养板，Costar；盖玻片（玻璃材质，22 mm×22 mm），载玻片（玻璃材质，25 mm×75 mm），江苏世泰实验器材有限公司。

1.3 菌种的培养与前处理

参考文献[8]方法，将冻藏在-80℃的鼠伤寒沙门氏菌在TSA平板上转接2次，挑取单菌落接种于5 mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃以120 r/min振荡培养16 h至生长稳定期，4 500 r/min离心10 min，弃去上清液，用5 mL磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，重新悬于一定量的无菌磷酸盐缓冲液中制备对数期菌悬液（约为109），涡旋振荡均匀用于后续试验。

1.4 鼠伤寒沙门氏菌菌膜培养与观察

1.4.1 结晶紫染色观察鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜 在6孔平底板（放置22 mm×22 mm的盖玻片）中加入200 μL上述菌悬液并加入5 mL TSB培养基，在30 ℃培养 0，12，24，36，48 h 后取出盖玻片，用无菌磷酸盐缓冲液洗去浮游菌；用250 μL的无水甲醇固定15 min，自然风干后用0.1%的结晶紫染色5 min，用无菌磷酸盐缓冲液洗至无紫色脱出，自然干燥，置显微镜下观察，同时做空白对照[9]。

1.4.2 培养时间对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成的影响 将20 μL上述菌悬液与200 μL TSB加入96孔板，同时加入220 μL TSB基孔作为阴性对照，置于生化培养箱中培养 0，12，24，36，48，72，96 h后，吸出培养液，加入 200 μL的 PBS洗涤3次以除去浮游菌，自然干燥，加入220 μL的无水甲醇固定15 min，自然风干后，加入0.1%的结晶紫染色5 min，吸出结晶紫，用无菌磷酸盐缓冲液洗至无色，室温干燥后加入33%的冰醋酸处理10 min，在多功能酶标仪570 nm处测其OD值，试验重复3次取平均值[10]。

1.4.3 乙醇含量及作用方式对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成的影响 将20 μL菌悬液与200 μL TSB加入96孔板培养24 h后，吸出培养液，用220 μL的PBS洗涤3次除去浮游菌，干燥后加入200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10% 乙 醇 含 量 的TSB，锡箔纸封住后再培养24 h；或将20 μL菌悬液分别与 200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10%乙醇含量的TSB加入96孔板，置于30℃生化培养箱中培养48 h。同时加入220 μL TSB基孔作为阴性对照，达到时间后吸出培养液，加入200 μL的PBS洗涤3次以除去浮游菌后，操作过程如1.4.2节，用酶标仪在570 nm处测其OD值，试验重复3次取平均值。

1.5 5%乙醇适应对鼠伤寒沙门氏菌及菌膜耐致死胁迫的影响

1.5.1 乙醇适应处理在平板上挑取单菌落接种于5 mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃以120 r/min振荡培养16 h至生长稳定期，4 500 r/min离心10 min，弃去上清液，用5 mL的磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，沉淀重悬于3.5 mL乙醇含量为5%的TSB中，涡旋振荡均匀得到对数期菌悬液。从同一管菌悬液中分别取1 mL装于两管15 mL的离心管，8 000 r/min离心10 min后，沉淀分别重悬于10 mL 0%、5%乙醇含量的TSB，25℃/170 r/min孵化1 h，涡旋均匀用于后续试验[11]。

1.5.2 菌膜形成过程中5%乙醇适应菌对苹果酸的耐受性在6孔平底板（放置了22 mm×22 mm 的盖玻片）中加入200 μL乙醇适应菌或未经处理的菌悬液，再加入5 mL苹果酸质量浓度为0，0.5，1，1.5 mg/mL 的 1/10 TSB，置于生化培养箱中培养48 h后，用无菌PBS缓冲液冲洗盖玻片3次以除去浮游菌，将盖玻片置于装有5 mL生理盐水和玻璃珠的离心管中涡旋1 min，取1 mL菌悬液进行10倍稀释。

1.5.3 5%乙醇适应处理过的浮游菌对12%乙醇的耐受性 取0.1 mL乙醇适应菌或未经乙醇处理的菌悬液接种于10 mL乙醇含量为2%的TSB中，25 ℃ 170 r/min 孵化 200 min。在50，100，150，200 min处取出1 mL菌悬液进行10倍稀释[12]。

1.5.4 5%乙醇适应处理过的浮游菌对5 mg/mL苹果酸的耐受性 取0.1 mL乙醇适应菌或未经乙醇处理的菌悬液接种于10 mL苹果酸质量浓度为5 mg/mL的TSB中，25℃ 170 r/min孵化200 min。在50，100，150，200 min处取出 1 mL 菌悬液进行10倍稀释。

1.6 细菌平板菌落计数

为了测定鼠伤寒沙门氏菌菌落数，按照1.5.2节操作选取合适的稀释倍数将100 μL稀释液均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基，37℃生化培养箱中培养16 h后取出进行菌落计数，试验重复3次取平均值。

1.7 数据分析

试验数据进行标准偏差分析，采用Origin 9.0软件作图。

2 结果分析

2.1 结晶紫染色确定鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜的形成

图1为鼠伤寒沙门氏菌在玻璃表面分别培养0，12，24，36，48 h 后经结晶紫染色处理后在偏光显微镜下的观察图。

图1 结晶紫染色法观察鼠伤寒沙门氏菌的生物菌膜Fig.1 Formation of S.typhimurium biofilm observed by crystal violet staining

培养0 h后，未见明显红色菌体即无生物膜形成（图1a）；培养12 h时的玻璃表面已经有少量红色菌体，菌落数较少，呈现稀疏松散的结构特征（图1b）；培养24 h后，菌体明显聚集即连接的菌体数显著增多，膜结构趋向紧密有序，此时菌体已经发生可逆的粘附（图1c）；培养36 h时菌体粘附范围扩大，细菌生物膜继续生长，且出现环状连接结构，菌体出现不可逆的粘附（图1d）；培养48 h后整个视野中菌体数量显著增多，菌体也更分散（图1e）。结晶紫染色可直观观察生物菌膜的形成过程，细菌从浮游菌状态到生物菌膜形成是一个复杂但有序的过程，生物菌体数量从少到多，生物菌膜也逐渐成熟。这与李红爱等[13]报道的单增李斯特菌生物菌膜的形成过程相一致。

2.2 培养时间对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜生物量的影响

酶标仪在570 nm处测定不同培养时间的鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜OD值，见图2。

随着培养时间的延长，鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜的OD值逐渐增大，进一步说明鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜的形成是一个由少到多的过程。整个菌膜的增长过程较缓慢，在24～72 h之间生物膜增长相对较快，这与结晶紫染色法观察到的试验结果相一致。本研究结果表明，鼠伤寒沙门氏菌菌膜在培养48 h后才趋于成熟。

2.3 乙醇含量及作用方式对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成的影响

乙醇作用方式对鼠伤寒沙门氏菌菌膜形成有显著的影响（图3）。低含量乙醇与菌悬液同时加入培养48 h，由于乙醇抑制作用而限制了菌膜的形成，且随着乙醇含量的增加，抑制作用越明显。而培养24 h后再加入不同乙醇含量的TSB肉汤，5%～10%的乙醇均能促进菌膜的形成，5%的乙醇促进效果最为显著，这与何守奎等人报导相一致。Buttke[14]等报导细菌暴露在低含量乙醇下膜蛋白结构和功能发生可逆变化，合成更高比例的不饱和脂肪酸脂类，从而使其呈指数级增长，而低含量的乙醇对菌膜的影响机理尚不明确。为了更有效地防控鼠伤寒沙门氏菌带来的食品安全风险，鼠伤寒沙门氏菌及菌膜在低含量的乙醇中的生长机制值得进一步探究。

图2 鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜培养光密度随时间的变化Fig.2 Changes in the optical density of S.typhimurium biofilm within 96 h

图3 乙醇含量及作用方式对鼠伤寒沙门氏菌菌膜形成的影响Fig.3 Effect of ethanol content and activity on S.typhimurium biofilm formation

2.4 菌膜形成过程中5%乙醇适应菌对苹果酸的耐受性

在鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成过程中，5%的乙醇适应能增加菌体对苹果酸的耐受性，随着苹果酸浓度的增加，这种耐受性显著增强（图4）。在营养条件为1/10 TSB生长时乙醇适应菌才对苹果酸具有耐受性，在TSB生长时乙醇适应菌对苹果酸无耐受性，这可能与菌体的生长状态，营养环境、苹果酸浓度等共同作用有关。

图4 菌膜形成过程中乙醇适应菌对苹果酸的耐受性Fig.4 Effect of ethanol adaptation on the tolerance of malic acid in the process of S.typhimurium biofilm formation

2.5 5%乙醇适应处理过的浮游菌对12%乙醇的耐受性

随着时间的增加，12%乙醇含量下乙醇适应组的菌浓度始终高于对照组，两组菌均在100～150 min时间段衰减最快，在150 min处两者菌浓度差值最大。孵育200 min后，适应组和对照组的菌浓度均减少了约1 lg（CFU/mL），但适应组的菌浓度比对照组高了约0.2 lg（CFU/mL）。这表明5%乙醇适应能增加菌体对亚致死乙醇含量的耐受性。

图5 5%乙醇处理的鼠伤寒沙门氏菌对12%乙醇的作用Fig.5 Effect of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of S.typhimurium in 12%ethanol

2.6 5%乙醇适应处理过的浮游菌对苹果酸的耐受性

在5 mg/mL苹果酸作用下，乙醇适应组与对照组的菌浓度随着时间的增加而减少，经5%乙醇处理的试验组的菌浓度始终高于对照组（图6），孵育200 min后对照组减少了约0.96 lg（CFU/mL），而适应组减少了约 0.73 lg（CFU/mL），200 min后乙醇处理的适应组菌浓度较对照组高0.27 lg（CFU/mL），说明5%的乙醇适应处理增强了菌体对苹果酸的耐受性。已有研究证实乙醇适应处理能增加副溶血弧菌对醋酸和乳酸的耐受性及肠炎沙门氏菌对苹果酸的耐受性，这与rpos和SEN1564A等酸耐受基因的上调有关，也有研究表明菌体经过乙醇适应后细胞脂肪酸组成和蛋白质谱发生表型改变[15]。

图6 5%乙醇处理的鼠伤寒沙门氏菌对苹果酸的耐受性Fig.6 Tolerance of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of Salmonella typhimurium in malic acids

3 结论

鼠伤寒沙门氏菌能在玻璃表面形成生物菌膜，且随着时间的延长，生物菌膜形成的网状结构更为致密，生物量显著增多。乙醇作用方式对菌膜形成有显著影响，加入不同含量的乙醇后培养48 h能显著抑制菌膜的形成，而预先培养24 h后再加入5%的乙醇能显著促进菌膜的生长。在菌膜形成过程中，营养条件为1/10 TSB条件下，5%乙醇适应能增加菌体对苹果酸的耐受性，增加浮游菌对12%的乙醇及5 mg/mL苹果酸的耐受性。因此，在寻求抑制鼠伤寒沙门氏菌的方法时，应特别关注乙醇和苹果酸对鼠伤寒沙门氏菌菌体的交叉保护作用。同时，在汉堡、酱油、发酵食品、果汁饮料等生产过程中要注意乙醇对菌体的适应性影响，以防出现鼠伤寒沙门氏菌及菌膜的乙醇适应性生长，导致这类产品潜在食品安全风险。