婴幼儿乳粉和米粉中阪崎克罗诺杆菌的耐受性研究

曹晨阳 孟令缘 王嘉炜 赵晓阳 杨保伟

（西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌 712100）

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种革兰氏阴性致病菌，常污染乳及乳制品，可引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症，死亡率高达50%以上[1-3]。即使治愈，也可能使神经系统产生后遗症[4]。近几年，随着国内外一系列与阪崎克罗诺杆菌相关的污染事件的爆发，该菌受到研究者的广泛关注[5-8]。目前，对阪崎克罗诺杆菌确切的污染来源尚不清楚，许多病例表明婴幼儿配方乳粉是该菌的主要感染载体[9]。

如果婴幼儿进食染菌的乳粉和米粉，该菌则随食物进入婴幼儿体内，导致疾病。婴幼儿乳粉/米粉冲调时使用温水和/或微波加热，这样的处理肯定会或多或少的对菌体产生影响。乳粉/米粉冲调时，其中的阪崎克罗诺杆菌没有被高温和/或微波杀死，随着食物进入婴幼儿体内后，消化系统（特别是胃液）的pH值、肠道中的乳酸菌或发生腹泻后服用妈咪爱等婴幼儿常用药物也会对该菌的生长产生一定的抑制或杀灭作用。虽然上述因素均会在一定程度抑制外源污染的阪崎克罗诺杆菌，甚至杀灭菌体，但目前除了对该菌的耐热性能研究较多外[10-14]，尚无研究揭示阪崎克罗诺杆菌对其它因素的耐受性。本研究基于婴幼儿进食乳粉/米粉时常规操作和部分人体生理条件，阐明阪崎克罗诺杆菌对这些条件的耐受性，为指导乳粉/米粉合理冲调和保障婴幼儿食品安全提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC BAA-894由中国食品药品检定研究院提供，分离于婴幼儿配方乳粉和米粉中不同基因型的阪崎克罗诺杆菌 11-19（1）、12-4（1）、12-8（1）、12-13（2）、13-8（2）、13-2（1）、14-20（1）、14-15（2）、14-4（1）、15-9（2）、18-16（1）、18-8（1）、18-24（1）、18-12（2）和18-14（1）由西北农林科技大学食品科学与工程学院微生物研究室提供。供试代表性菌株选择标准：分离于不同时间采集的不同品牌的婴幼儿乳粉或米粉，具有不同耐药表型和基于脉冲场 凝 胶 电 泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）的基因型，携带不同毒力基因。产乳酸菌素乳酸菌由西北农林科技大学食品科学与工程学院吕欣博士惠赠。

1.1.2 材料与试剂 LB琼脂培养基、LB肉汤培养基、MH琼脂培养基（MHA）和脑心浸液培养基（BHI），购自北京陆桥技术有限责任公司；妈咪爱，购自北京韩美药品有限公司；制作菌悬液用婴幼儿配方乳粉，购于陕西杨陵好又多超市，为适于较大婴儿及幼儿食用的2段配方牛乳粉。

1.1.3 主要仪器 高压灭菌锅（LAC-5080S），上海博讯；超净工作台（SW-CJ-1CU），苏州泰安；微量移液枪（Effendorf），德国；百分之一天平（XS204），梅特勒；恒温培养振荡器（ZHWY-211B），上海智诚。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和扩大培养 用接种环分别蘸取少量保存于-80℃ LB肉汤/甘油（50%/50%V/V）中的阪崎克罗诺标准菌株和分离株，划线接种到LB琼脂培养基表面，37℃培养18～24 h。从LB培养基上挑取一个单菌落，接种到20 mL BHI肉汤中，37℃、100 r/min下摇床培养10 h。

1.2.2 菌液初始浓度测定和存活率计算 取1 mL阪崎克罗诺杆菌BHI肉汤培养物，用生理盐水依次进行 10倍稀释，分别得到其 101，102，103，104，105和106倍稀释液。分别取各稀释液50 μL接种于LB平板上，涂布均匀后37℃下倒置培养18 h，计数。同时接种50 μL无菌生理盐水于LB平板表面作为阴性对照。每个稀释度（包括对照）共做3个重复。选择菌落分布均匀且皿内菌落数在30～300 CFU的稀释度的菌落数计算菌液的起始浓度。

存活率计算按照下列公式进行：

1.2.3 阪崎克罗诺杆菌对温度的耐受性测定 结合日常生活中乳粉冲调时使用的水温，分别选取50，60和70℃ 3个温度点进行研究。取1.2.1节中的BHI肉汤培养物1 mL加入到灭菌的装有10 mL冲调乳粉（用矿泉水按照乳粉生产商的推荐比例冲调，下同）的50 mL离心管中，振荡混匀，将离心管分别置于50，60和70℃的水浴中保温处理20 min，保温过程不断进行振荡使菌体受热均匀。处理结束后，按照1.2.2节所述方法，立即取样测定阪崎克罗诺杆菌的浓度并计算存活率，采用存活率衡量其对温度的耐受性。

1.2.4 阪崎克罗诺杆菌对pH的耐受性测定 将冲调好的乳粉高温灭菌后，使用无菌HCl和/或NaOH调整其pH 为4.0，6.0和8.0，确定每个离心管中调整pH值后的乳粉体积为20 mL后，分别向其中加入1 mL 1.2.1节中的BHI肉汤培养物，振荡匀后室温下静置20 min。处理结束后，按照1.2.2节所述方法，立即取样测定阪崎克罗诺杆菌的浓度并计算存活率，采用存活率衡量其对pH的耐受性。

1.2.5 阪崎克罗诺杆菌对微波处理的耐受性 取1 mL 1.2.1节中的BHI肉汤培养物，加入冲调好的10 mL无菌乳粉中。由预试验可知，10 mL冲调乳粉在微波炉中加热到60℃所需时间大约为2 min。通过秒表计时，对所有加有菌液的冲调奶粉进行微波处理2 min后，立即取样测定阪崎克罗诺杆菌的浓度并计算存活率，采用存活率衡量其对微波的耐受性。

1.2.6 阪崎克罗诺杆菌对乳酸菌的敏感性 首先向无菌培养皿底部平铺一层厚度约2 mm的乳酸菌培养基（de Man Rogosa Sharpe，MRS），待其凝固后，以划线法在培养基中间接种已经活化的乳酸菌，共划线2条。之后将100 μL 1.2.1节中培养得到的阪崎克罗诺杆菌菌液加入10 mL已灭菌并冷却至50℃的MHA培养基中，振荡混匀后水平倾注于MRS固体培养基上，凝固后于37℃恒温培养24～48 h，观察抑菌结果。采用垂直于乳酸菌划线方向抑菌区域的最大半径表示阪崎克罗诺杆菌的敏感性。

1.2.7 阪崎克罗诺杆菌对妈咪爱的敏感性 将购买的妈咪爱在LB肉汤中振荡过夜培养，备用。采用牛津杯法测定阪崎克罗诺杆菌对妈咪爱的敏感性，即：先在无菌培养皿底部平铺一层10‰的无菌琼脂，待琼脂凝固后，在其上方均匀放置4个无菌的牛津杯，再向皿内倒入适量的已灭菌并冷却至55℃左右的MHA培养基，待其冷却凝固后，使用涂布法将 100 μL（浓度约 108CFU/mL）阪崎杆菌菌液均匀涂布在MHA培养基表面。当液体被培养基充分吸收后，再用无菌镊子沿垂直于培养基的方向拔掉牛津杯，向牛津杯形成的孔洞中加入约100 μL妈咪爱培养物，37℃培养18～20 h后测量抑菌圈直径。采用抑菌圈直径和牛津杯外径的比值表示阪崎克罗诺杆菌的敏感性。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0对不同温度、pH、微波条件下阪崎克罗诺杆菌的存活率和对妈咪爱及乳酸菌的敏感性结果进行方差分析、多重比较（Tukey法）和卡方检验，得到阪崎克罗诺杆菌的耐受性结果。

2 结果与分析

2.1 阪崎克罗诺杆菌对温度的耐受性

阪崎克罗诺杆菌经50，60和70℃处理后的存活率见表1。50℃处理后，除12-8（1）和14-15（2）死亡较多外，其它菌株基本没有死亡，大部分菌株反而呈生长态势。当温度上升到60℃时，所有菌株都呈现出死亡的趋势。70℃时，所有菌株的存活率都低于0.11%。对3种温度处理后阪崎克罗诺杆菌浓度的对数值方差分析和多重比较（表2，表3）结果表明：50，60与70℃处理后菌株的存活率具有极显著差异。

表1 温度耐受试验结果Table 1 Results of anti-thermal test

表2 温度耐受试验方差分析结果Table 2 Results of variance analysis of anti-thermal test

表3 不同温度处理后存活率多重比较结果Table 3 Results of multiple comparison of survival rate at different temperatures

2.2 阪崎克罗诺杆菌对不同pH条件的耐受性

供试菌株在pH 4.0，6.0和8.0条件下处理后的存活率见表4。3种pH条件处理后，大部分菌株出现不同程度死亡。13-2（1）的死亡率均相对较高，说明该菌对 pH 比较敏感。18-8（1）、18-16（1）和18-12（2）经pH处理后还出现增长态势，表明对pH的耐受性非常强。

阪崎克罗诺杆菌经3种pH处理后存活率方差分析和多重比较结果（表5，表6）表明：pH 4.0条件处理与pH 6.0和pH 8.0条件处理后菌液浓度的对数值在1%水平上存在极显著差异。pH 6.0与pH 8.0条件处理后菌株存活率无显著性差异。

表4 酸碱耐受性试验结果Table 4 Results of anti-acid and anti-alkaline test

表5 酸碱耐受性试验方差分析结果Table 5 Results of variance analysis of anti-acid and anti-alkaline test

表6 不同pH处理后存活率多重比较结果Table 6 Results of multiple comparison of survival rate at different pH

2.3 阪崎克罗诺杆菌对微波处理的耐受性

微波处理对菌株存活率的影响主要体现在微波的杀菌作用，只要微波剂量足够，菌株基本都会死亡。研究中大部分菌株的死亡率高达99%（表7），卡方检验的结果表明供试菌株的存活率间无显著性差异（P＞0.05），即微波的杀灭作用较为普遍。

表7 微波处理后阪崎克罗诺杆菌的存活率Table 7 Survival rates of Cronobacter sakazakii after microwave treatment

2.4 阪崎克罗诺杆菌对乳酸菌的敏感性

乳酸菌在生长过程中会代谢产生具有抑菌活性的乳酸菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌均有一定的抑制作用[15]。乳酸菌对阪崎克罗诺杆菌抑制的最大半径见表8。菌株12-4（1）对乳酸菌最敏感，而 14-4（1）和15-9（2）的耐受性较强，表明产乳酸菌素的乳酸菌对阪崎克罗诺杆菌生长具有一定的抑制，多重比较结果表明不同菌株对乳酸菌的敏感性具有极显著的差异。

2.5 阪崎克罗诺杆菌对妈咪爱的敏感性

研究中牛津杯外径（即加样孔直径）为9.0 mm，抑菌圈直径及其与加样孔直径的比值如表9所示。由表9可知，妈咪爱对供试阪崎克罗诺杆菌均有一定程度的抑制作用。18-16（1）对妈咪爱最为敏感，18-8（1）相对不敏感，多重比较结果表明除部分菌株对妈咪爱的敏感程度存在极显著的差异外，其它菌株的敏感性较为相似。

表8 阪崎克罗诺杆菌对乳酸菌的敏感性Table 8 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Lactobacillus

表9 阪崎克罗诺杆菌对妈咪爱的敏感程度Table 9 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Mamiai

3 讨论

阪崎克罗诺杆菌是一种常见的食源性条件致病菌，在婴幼儿乳粉、米粉、奶酪、面包及豆腐等多种食品中均被检出[16]。自Muytjens等[17]于1983年从冲调乳粉的器具上分离到阪崎克罗诺杆菌，继而将其与婴幼儿乳粉联系起来后，世界多地，如：美国、丹麦、冰岛和新西兰等，均出现了由阪崎克罗诺杆菌引起的疾病暴发[18]。2011年，在美国俄克拉马州和密苏里州相继发生了婴儿感染阪崎克罗诺杆菌致死的事件，之后，美国的沃尔玛超市及一些零售商开始大规模召回婴幼儿乳粉[19]。这些事件的爆发表明研究与乳粉密切相关的阪崎克罗诺杆菌具有十分重要的意义。

研究中供试菌株为分离于不同时间、不同市场类型和城市中采集的不同品牌或批次的婴幼儿乳粉或米粉，这些菌株药敏性、基因型和携带的毒力基因均不相同，具有一定的代表性。研究中测试的温度和微波处理均为日常生活中乳粉和米粉冲调时常用的水温和加热处理方式，测试pH范围与婴幼儿胃液相当，因此研究这些理化条件对已经污染到食品中的阪崎克罗诺杆菌生存的影响具有一定的理论和实际指导意义。

目前，针对阪崎克罗诺杆菌对热及酸碱的耐受性研究较多，在国内，陈彬等[20]（2008）发现，分离自奶制品中的阪崎肠杆菌对高温都有相当的耐受性，用高于70℃的水冲调奶粉时，奶粉中阪崎肠杆菌的数量会至少减少4个数量级。姜琛璐等[13]（2014）研究发现，分离自重庆17个区县婴幼儿食品中的阪崎肠杆菌对50℃均表现出一定的耐受性，大部分菌株在60时死亡，70℃下所有菌株基本迅速失活。在国外，Breeuwer等[21]（2003）对分离自农场的阪崎肠杆菌的耐受性研究也表明其对热具有一定的耐受性。本研究在70℃条件下处理20 min，所有菌株的存活率都不高于0.11%，与上述结果基本一致。

对于阪崎克罗诺杆菌耐酸碱性的研究，姜琛璐[13]（2014）、柴云雷[22]（2014）和袁飞等[8]（2005）所得结果类似，设计的条件均在pH不高于2.0且不低于12.0的范围内，与本研究采用的范围不同。人体胃液的pH值约为0.9～1.5，小肠的pH值范围较广，为4.8～8.2[23]，而婴幼儿的胃液 pH值偏高[24]，新生儿正常胃液的pH值为5～6.8[25]，其中母乳喂养的婴幼儿胃液pH值约为2.7±0.3，奶粉喂养的婴幼儿为 3.6±0.2[26]，故选取 pH 4.0，6.0和8.0 3个条件。本研究中pH 4.0处理后存活率与其它2组具有极显著的差异，即：如果大量阪崎克罗诺杆菌进入婴幼儿体内，除了胃液可能会杀死部分菌株外，侵入其他组织的菌株很难被完全杀死，与标准菌株ATCC BAA-894存活率比较，可推测在同等条件下，pH同为4.0时，供试菌株的致病风险高于标准菌株。

微波杀菌是非热效应和热效应共同作用的结果[27]，本研究主要考虑用微波炉加热乳粉和/或米粉时微波的非热效应对于阪崎克罗诺杆菌的杀灭作用。预试验结果表明，使用研究开展实验室的微波炉加热10 mL乳粉到60℃需要2 min，而之前温度耐受性试验结果表明60℃对阪崎克罗诺杆菌的杀灭作用不明显，故对供试菌株微波处理2 min，可以在一定程度上排除微波热效应的影响。微波对阪崎克罗诺杆菌的杀灭作用尚无明确的报道，王绍林等[28]（1993）验证了微波杀菌非热效应的观点，王冬等[29]（2007）研究表明微波可以抑制并杀灭霉菌，肖平等[30]（2007）研究表明在一定火力范围内，鲜乳中细菌总数及大肠菌群数均随微波火力的增强而减少。本研究中，对阪崎克罗诺杆菌进行微波处理，验证了微波的非热效应对该菌的杀灭作用明显，且供试菌株与标准菌株存活率间无显著性差异，为婴幼儿乳粉冲调提供指导，也为后续研究提供参考。

除理化因素对阪崎克罗诺杆菌有一定的抑制作用外，生物因素也对其有一定的影响。健康人体肠道中常驻有乳酸菌，即使乳粉或米粉中污染的阪崎克罗诺杆菌未在冲调过程被杀死，随食品进入肠道后，肠道内乳酸菌也会对其产生拮抗或抑制作用。杜静芳等[31]（2016）在筛选和鉴定拮抗阪崎肠杆菌乳酸菌时，采用双层琼脂扩散法产生抑菌圈直径大小来衡量该乳酸菌对阪崎肠杆菌的抑制作用，其抑菌圈直径最大为19.89 mm。吴玲等[32]（2011）采用管碟法对分离自泡菜中的乳酸菌对阪崎肠杆菌的抑制作用结果表明乳酸菌对其具有一定的抑制作用，其抑菌圈直径最大为16.2 mm。本研究采用的抑菌方法有所不同，但结果基本一致，不同菌株对乳酸菌的敏感程度有明显差异，肠道内乳酸菌可能不会完全杀死进入肠道的阪崎杆菌。当婴幼儿由于阪崎克罗诺杆菌进入其体内引起腹泻后，会服用妈咪爱等微生态制剂类婴幼儿药物，其主要成分为粪链球菌和枯草杆菌。钟有添等[33]（2006）研究了妈咪爱对肠道致病菌、条件致病菌及其L型的抑菌作用，结果表明妈咪爱在体外对大肠埃希菌、福氏志贺菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、自假丝酵母菌及其L型皆有不同程度的抑菌作用，并且浓度越大，抑菌作用越强。目前，妈咪爱对阪崎克罗诺杆菌的抑制作用的研究尚未报道，本研究发现标准菌株与大部分供试菌株对妈咪爱的敏感程度较为相似，妈咪爱对阪崎克罗诺杆菌引起的疾病有一定的治疗效果。

婴幼儿食品安全问题已成为当前人们最关注的食品安全问题之一。研究阪崎克罗诺杆菌对温度、酸碱及微波的耐受性，这将为婴幼儿乳粉/米粉的合理冲调提供指导，了解其对乳酸菌和妈咪爱的敏感性，有助于保障婴幼儿食品安全及婴幼儿身体健康。另外，获得阪崎克罗诺杆菌对微波的耐受性及对妈咪爱的敏感性结果，可以为日后研究微波的非热效应及微生态制剂对阪崎克罗诺杆菌的杀灭作用提供理论基础。