硫元素限制对粘性丝孢酵母油脂积累的影响

包汭琪 吴香莹 刘洒洒 谢同舟 高 宁 林心萍

（大连工业大学食品学院 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连 116034）

微生物油脂，又称为单细胞油脂，是指在一定条件下酵母、细菌、霉菌和藻类等微生物通过利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源，所积累的大量油脂[1-2]。对于微生物油脂的早期研究主要集中在γ-亚麻酸（GLA）[3]、花生四烯酸（ARA）[4]、二十碳五烯酸（EPA）[5]、二十二碳六烯酸（DHA）[5]等功能性油脂的开发上[6]。有文献表明，微生物油脂是化石能源的理想替代品，它不仅可再生，而且还可作为食用油脂[7-8]。近年来由于化石能源供应逐渐紧张，使微生物油脂得到广泛关注[9]。为节约成本，目前大多数研究以低成本天然原料如菊芋水解液[10]、木质纤维素水解液[11]或氨基酸工业废水[12]等为底物，且多采用氮元素限制来调控微生物油脂产量[13-14]，然而，这些原料碳氮比较低，脱氮较为困难。开发限氮之外的调控方式具有较好的前景。

硫（S）在微生物细胞生长及生理代谢活动中扮演重要角色[15]，参与合成诸多辅酶如生物素、辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、硫胺素、硫辛酸和铁硫簇合[16]。有研究表明，微生物发酵过程中硫元素的限制供应会直接影响细胞增殖[17-18]，从而摄取更多的碳元素并将其转化为油脂储存在微生物细胞内。Wu等[19]以葡萄糖为碳源，对Rhodosporidium toruloides（圆红冬孢酵母）Y4进行发酵，发现在培养基中 n（C）/n（N）为 28.3～5.7 且 n（C）/n（S）为11 380时油脂含量基本稳定在57%左右，这表明无论培养基中是否存在较高的 n（C）/n（N），硫元素的限制都会有效提升菌体中的油脂含量。王雅南等[20]以葡萄糖为碳源，对圆红冬孢酵母AS 2.1389进行发酵，发现硫元素限制能提高胞内油脂得率和油脂含量，使圆红冬孢酵母在胞内积累高于干重60%的微生物油脂。然而，硫元素限制是否适用于果糖为碳源的培养情况，尚未有文献研究。本研究以粘性丝孢酵母CICC 1368为目标菌株，考察了培养基中硫元素的限量供应对果糖转化为油脂的影响，为后期基于天然底物发酵的微生物油脂的工业化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 粘性丝孢酵母（Trichosporon fermentans）CICC 1368购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基 种子培养基：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH 6.0。

限硫培养基：果糖 70 g/L，MgCl2·6H2O 1.5 g/L，NH4Cl 5.42 g/L，Na2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，痕量元素溶液10 mL/L。以Na2SO4为硫元素的添加，质量浓度分别为 2.0，1.0，0.5，0.1，0.05和0.01 g/L，pH 6.0。

最优限硫培养基：果糖 70 g/L，MgCl2·6H2O 1.5 g/L，NH4Cl 5.42 g/L，Na2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，Na2SO40.1 g/L，痕量元素溶液 10 mL/L，pH 6.0。

痕量元素溶液配方：CaCl2·2H2O 4.0 g/L，水合柠檬酸 0.52 g/L，FeSO4·7H20 0.55 g/L，MnSO4·H2O 0.076 g/L，ZnSO4·7H2O 0.10 g/L，100 μL 18 mol/L H2SO4。

1.2 方法

1.2.1 发酵试验 将活化的酵母菌接种于50 mL种子培养基中，200 r/min，28℃培养24 h。7 800 g离心8 min，0.9%无菌生理盐水清洗两次后用50 mL的0.9%无菌生理盐水将菌体重悬。种子液以10%（V/V）接种量接种于45 mL生产培养基中，200 r/min，28℃培养，每24 h用2 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠将pH调至5～7左右，至任意一组碳源被充分利用时结束发酵。

1.2.2 菌体生物量的测定[21]取一定体积的发酵液，于8 000 g离心5 min，去除上清后用去离子水清洗两次，105℃下将菌体烘干至恒重，对菌体生物量进行计算（g/L）。

1.2.3 残糖的测定[22]采用DNS法对培养基中果糖的剩余量进行测定。取1 mL发酵液和1 mL DNS试剂混合，沸水浴5 min，冷却后加入8 mL蒸馏水，混匀后于540 nm处测其吸光度值。标准曲线公式为y=1.4993x-0.0347（R2=0.999）。

1.2.4 低场核磁检测微生物油脂含量 将发酵后的菌体离心，收集沉淀，干燥至恒重，制得干菌体样品；利用低场核磁共振对各样品的低场核磁CPMG衰减曲线信号进行收集，具体参数设置如下：90 度脉宽 P1：13 μs；180 度脉宽 P2：24 μs；重复采样等待时间 Tw：2 000 ms；模拟增益 RG1：10；数字增益 DRG1：3；前置放大增益 PRG：2；重复采样次数 NS：32；回拨个数 NECH：2 000；接收机带宽SW：200，300 kHz；开始采样时间的控制参数RFD：0.02 ms；时延 DL1：0.2 ms进行核磁共振信号采集。将收集的CPMG衰减曲线信号除以各样品的实际质量，并对应时间进行作图，获得单位质量油脂的低场核磁CPMG信号，对菌体中的油脂进行初步预估。

1.2.5 油脂的提取 采用酸热法[23]，每克菌体加入10 mL 4.0 mol/L盐酸，于78℃水浴消化1.5 h。冰浴冷却后加入2倍体积的氯仿/甲醇溶剂（1∶1，V/V），充分振荡 1 h，于 8 000 r/min 离心 5 min，收集下层有机相。上层溶液加入等体积的氯仿，充分振荡1 h，8 000 r/min离心5 min，收集有机相。合并有机相，加入等体积的0.1%氯化钠溶液去乳化，充分混匀后于8 000 r/min离心5 min。用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发除去有机溶剂，105℃烘干至恒重。以 g/L（每升发酵液中含油脂的克数）表示油脂量；油脂含量为油脂量占生物量的质量百分数；油脂得率为每克糖所生成的油脂质量。

1.2.6 菌油脂肪酸组分分析 脂肪酸甲酯化处理：取油脂约0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L氢氧化钾/甲醇溶液，于60℃水浴2 h。冷却后用6 mol/L盐酸将pH调节至低于1.0，用10 mL正己烷进行萃取，然后氮吹至恒重，再加1 mL正己烷和2 mL甲基化试剂，于70℃水浴1 h，冷却后移出正己烷层并将其水洗至中性，用无水硫酸钠过夜干燥。

样品采用安捷伦6890N GC-5973 MSD气相色谱-质谱联用仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）分析。HP-5-MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气。分析条件：50℃，保持1 min，以50℃/min升至170℃，然后以4℃/min升至300℃，随后以40℃/min升到320℃，保持3.6 min，采用全扫描模式，离子源采用EI源（70 eV），溶剂延迟 4 min，扫描范围为50～550 m/z。

2 结果与分析

2.1 低场核磁共振检测不同浓度的硫酸盐下粘性丝孢酵母中油脂含量

首先采用低场核磁共振对培养基中不同浓度的硫酸盐下粘性丝孢酵母的油脂信号进行测定，并换算为单位质量油脂信号响应，由此来快速检测各样品中油脂含量的差异。本试验通过调节Na2SO4的添加量，设置 6 种不同 n（C）/n（S）的培养基，形成 n（C）/n（S）分别为 180，331，662，3 310，6 619和33 095的6种培养环境。如图1所示，在含有 2.0，1.0，0.5 g/L Na2SO4的合成培养基中，单位质量菌体中油脂的CPMG信号无明显差异，且低于含 0.1，0.05，0.01 g/L Na2SO4的合成培养基。该结果表明，n（C）/n（S）的提高，会进一步提升粘性丝孢酵母的油脂积累能力。以上结果说明低场核磁共振可作为一种快速预估油脂含量的有效手段。刘婷婷等[24]也利用了低场核磁共振技术对小球藻中的油脂含量进行快速检测，其信号强度与细胞中的油脂含量存在线性关系，拟合度R2大于0.99，证实此快速检测技术是可行的。因此，低场核磁检测技术未来可作为一种快速无损的微生物油含量分析检测技术手段。

图1 粘性丝孢酵母CICC 1368在不同Na2SO4浓度下培养后的微生物油脂含量CPMG衰减曲线分析Fig.1 Lipid content CPMG decay curve analysis of T.fermentans CICC 1368 in the presence of various amounts of Na2SO4

2.2 不同浓度的硫酸盐对粘性丝孢酵母生长及产油的影响

为进一步了解不同浓度的硫酸盐对粘性丝孢酵母生长及产油的影响，对各组样品的生物量、残糖、油脂产量等进行测定，结果如表1所示，随着培养基中硫元素浓度的降低，生物量呈逐渐下降的趋势，表明硫元素缺乏时，并不利于菌体繁殖。从油脂含量结果中还可看出粘性丝孢酵母在添加了0.1，0.05，0.01 g/L Na2SO4的合成培养基中的油脂含量高于添加了2.0，1.0，0.5 g/L Na2SO4的合成培养基，这与低场核磁共振结果相吻合。此外，随着培养基中 n（C）/n（S）的升高，菌体油脂含量呈持续上升趋势，从12.4%上升到50.0%，说明硫元素限制会使更多碳代谢流转向油脂合成，从而使干菌体中油脂含量增加。但当n（C）/n（S）超过3 310后，菌体油脂含量虽呈持续增加，但生物量却明显下降，油脂生产量也从8.9 g/L下降至3.1 g/L，油脂生产强度同样呈下降趋势，降至0.026 g/L/h，油脂得率降至0.121 g/g糖。此外，残糖呈现上升趋势，推测可能由于过度硫限制抑制了菌体的生长，从而影响了其对底物的利用。Wu等[19]也在研究中发现硫元素限制条会使圆红冬孢酵母Y4中油脂产量及油脂得率大幅度升高，但过度限制硫元素也会使油脂产量下降。本试验通过考察不同浓度硫元素对粘性丝孢酵母产油影响，表明硫元素限制能有效提高产油酵母油脂的积累，但是硫元素的调控必须控制在一个适当的范围内。

表1 不同浓度的Na2SO4条件下粘性丝孢酵母生长及产油结果Table 1 Conditions and results of lipid produced by T.fermentans CICC 1368

2.3 不同浓度的硫酸盐对粘性丝孢酵母油脂成分的影响

采用 GC-MS 对不同 n（C）/n（S）培养条件下所得的油脂样品进行分析，粘性丝孢酵母油脂中脂肪酸成分结果如表2所示，油酸（C18：1）为主要脂肪酸，而硬脂酸（C18：0）、棕榈酸（C16：0）和亚油酸（C18：2）所占比例也较大，这4种脂肪酸含量的总和基本超过脂肪酸总量的90%，分别在Na2SO4的添加量为 0.1，0.05，1.0，0.5 g/L时含量最高，分别为54.94%，26.55%，25.62%，10.91%。此外，硫元素的限制对饱和脂肪酸肉豆蔻酸（C14：0）、花生酸（C20：0）、山萮酸（C22：0）和木蜡酸（C24：0）含量的影响较小，且它们的含量始终处于较低水平。从表2中还可看出除了Na2SO4的添加量为1.0 g/L时，其余条件下不饱和脂肪酸总含量均高于饱和脂肪酸总含量，且随 n（C）/n（S）的升高，不饱和脂肪酸总含量呈先上升后下降的趋势，在Na2SO4的添加量为0.1 g/L时，不饱和脂肪酸总含量达到最高，为57.44%，若继续降低Na2SO4浓度，不饱和脂肪酸总含量开始降低，说明培养基中适当硫元素才会有利于不饱和脂肪酸的积累，其中含量最高的不饱和脂肪酸为油酸，它同样在Na2SO4的添加量为0.1 g/L时含量达到最大，为54.94%。微生物油脂中的长链脂肪酸组分和植物油相似[25]，表明粘性丝孢酵母在限硫条件下所积累的微生物油脂可能作为生物柴油的原料。

表2 不同浓度的Na2SO4条件下粘性丝孢酵母脂肪酸成分分析Table 2 Fatty acid compositions of the total lipid produced by T.fermentans CICC 1368 in different Na2SO4levels

2.4 最优限硫条件下粘性丝孢酵母油脂积累过程

为了更好地理解硫元素限制条件下的油脂生产动力学，我们对最适 n（C）/n（S）条件下粘性丝孢酵母的生长和产油过程进行了检测。结果如图2所示，底物在120 h被消耗完，残糖为0 g/L。培养过程中，粘性丝孢酵母的生物量持续增加，发酵终点时为21.1 g/L。粘性丝孢酵母的油脂产量在72 h前呈缓慢上升趋势，72 h后上升趋势显著，到达发酵终点时其油脂产量达到最大，为9.0 g/L。其油脂含量和油脂产量趋势相似，发酵终点干菌体油脂含量达到最大，为42.3%。油脂产量和干菌体油脂含量出现这种趋势的原因，可能是前72 h粘性丝孢酵母碳代谢流多流向了细胞生长方向，而培养72 h后碳代谢流更多地流向了油脂合成的方向。

图2 Trichosporon fermentans CICC 1368碳源消耗、细胞增长和油脂积累动力学曲线Fig.2 Carbon source consumption，cell growth and lipid accumulation of Trichosporon fermentans CICC 1368

3 结论

采用硫元素限制对粘性丝孢酵母的油脂积累进行调控。油脂提取结果及核磁分析结果均表明，适当地提高培养基的n（C）/n（S）能够促进微生物的油脂积累，且低场核磁共振可作为一种分析微生物油脂含量的有效手段。油脂含量和油脂得率会随着 n（C）/n（S）的增加，呈先上升后下降的趋势。脂肪酸成分分析结果表明，菌油中油酸含量最高，棕榈酸、硬脂酸以及亚油酸也占较大比重。n（C）/n（S）对脂肪酸的组成影响不大，但对于脂肪酸的含量会有一定的影响，适当地限制硫元素会促进总不饱和脂肪酸的积累。因此可通过对硫元素的调控，直接调控菌油的脂肪酸含量。综合考虑以上试验的结果得出，3 310 为最适 n（C）/n（S），粘性丝孢酵母在该条件下培养120 h后，生物量可达到21.1 g/L，油脂产量可达到9.0 g/L、干菌体油脂含量可达到42.3%。本研究限硫条件下微生物油脂的积累提供了理论依据。