基因敲除技术在微生物中的应用

王 雪,黄建忠，李 力

(福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108)

基因敲除技术，又名基因打靶，自20世纪80年代发展起来，主要建立在同源重组的基础上，属于一种新型分子生物学技术。经典的基因敲除技术是指通过同源重组原理将标记基因定点地整合入目标细胞基因组上某一特定的位点，以达到细胞内某一目的基因敲除的一种技术。基因敲除技术已经广泛应用于动植物、微生物，应用形式多种多样，主要有同源重组法、随机插入突变法、RNA干扰法、ZFNs法、TALEs法，此外，还有目前热点研究的CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除技术。基于同源重组的基因敲除技术主要有RecA系统同源重组法、Red系统同源重组法、基于自杀载体的同源重组法、基于温敏型质粒的同源重组法。这四种方法各有优缺点，要根据不同的微生物不同的条件选择不同的方法，其基本原理如图1。基因敲除技术的热门也使得一大批发明专利涌现。本文对几种广泛应用于微生物的基因敲除方法进行介绍，并提供一些成功案例及发明专利，各种方法的比较见表1。

图1 同源重组法进行基因敲除的一般原理Fig.1 Ceneral principles of gene knockout by homologous recombination

表1 基因敲除方法的比较Table 1 Comparison of gene knockout methods

注：“-”表示无特定质粒

1 基因敲除技术原理

1.1 RecA系统同源重组法

RecA同源重组系统是大肠埃希菌中的内源性同源重组机制，组成它的蛋白质包括RecA蛋白和RecBCD等[1]。RecA具有双重功能，它不但能改变单链的DNA分子还可以激活蛋白酶，是大肠埃希菌recA基因座的产物，具有单、多聚体两种形式，可以参与大肠埃希菌中任何同源重组机制。RecA蛋白是纤维状的，能够参与DNA损伤的修复，总的来说，它有两个主要功能，一是能够促进DNA分子链之间的交换，二是作为共蛋白酶可以促进阻遏蛋白LexA的自我水解，蛋白RecBCD就是三种蛋白质RecB、RecC、RecD的复合体，这三种蛋白质可以解开DNA双链，在Chi位点处形成DNA单链[2]。但是通过RecA系统难以成功获得基因缺失突变株，其具有以下3个缺点：①重组的概率很低；②构建重组载体时需要的同源臂较长；③RecBCD蛋白具有核酸外切酶的活性，可以降解线性的DNA片段给替换载体的构建带来了困难。因此，由于RecA同源重组系统需要依赖于特定的限制性内切酶酶切位点，并且需要的同源臂较长，具有操作复杂等缺点，现已很少被使用[3]。

1.2 Red系统同源重组法

Red重组系统来源于λ噬菌体，包括Exo、Beta、Gam3三种蛋白质，进行基因敲除时将编码这三种蛋白质的基因克隆入载体，利用基因翻译成相应的蛋白质，使得同源基因重组能够顺利进行。在这三种蛋白质中Exo蛋白具有λ核酸外切酶活性，能够从DNA单链的5′端向3′端降解，最后产生3′突出末端而Beta蛋白恰能与这个有3′突出末端的DNA片段结合，介导其互补链的退火且保护这个DNA分子不被降解，最重要的是Exo蛋白有重组酶活性可以促使同源重组，Gam蛋白的作用则是防止导入目的菌株的DNA分子被核酸外切酶降解，其分子量约为16 000 Da，与核酸外切酶结合能够有效抑制核酸外切酶的活性[4]。微生物在Red系统的作用下能够明显提高同源重组发生的概率，具有效率高的优点。2000年首创两步同源重组法，在辅助性质粒pKD46中表达Red同源重组系统，在构建质粒载体的过程中，设计引物所需的同源臂长度得到了大大缩短，克服了RecA系统同源重组法复杂、同源臂长的缺点[5]。Red同源重组技术的主要研究对象是大肠埃希菌，但同时它还能够应用于其他细菌甚至病毒中，两步同源重组法是Red系统同源重组方法中最经典的方法，该方法目前得到广泛应用。所谓两步同源重组法就是第一步同源重组质粒与染色体上的靶基因进行替换，第二步利用pCP20质粒将抗性基因敲除掉。下面就两步同源重组法的一般策略加以说明：①将带有Red重组系统的pKD46质粒导入目的菌株，使目的菌株能够产生三种蛋白重组酶，为基因敲除做准备；②构建重组质粒，该重组质粒两侧有靶基因的上下游同源臂，中间是一段抗性基因，含有FRT位点；③制备感受态细胞，将构建好的重组质粒用电转法导入目的菌株的感受态细胞中，要事先加入L-阿拉伯糖，它可以诱导Red重组系统中三种蛋白质的表达，促进同源重组；④在LB培养基上加入相应的抗性基因，进行重组子的筛选，能够在加有抗生素的LB培养基上生长的菌株就是发生了基因敲除的突变体；⑤将温敏型质粒pCP20导入突变菌株中，用来消除抗性基因；⑥42 ℃培养24 h以上，去除温敏型质粒pKD46。Wang等[6]利用两步同源重组法成功敲除了毕赤酵母中α-1,6-甘露糖转移酶(ochlp)基因，得到ochl基因缺失突变株，研究了融合蛋白(HAS/GM-CSE)的表达。两步同源重组法只是Red系统重组法中最为重要最为经典的一种，在此基础上又发展出其他一些方法，比如双质粒基因敲除法、单质粒基因敲除法，较两步同源重组法又有一些新的优点，双质粒基因敲除法用两个质粒，其中一个为辅助性质粒，另一个为供体质粒。单基因敲除法只需一个质粒就能完成敲除，在染色体上没有残余序列。

在实际的基因敲除操作中往往都是Red两步同源重组法的延伸，根据不同的菌株与操作条件适当取舍。苏莉等[7]采用Red重组方法依次对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7的Z1444和Z0986基因进行敲除，成功构建出敲除卡那霉素抗性基因的双缺失突变株。杨冬美等[8]从野生型菌株E.coliW3110出发，利用Red系统同源重组法，将大肠埃希菌tdcC、sstT、和livJ系统基因敲除，得到单缺失和双缺失菌株，考察了相应系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响。Shi等[9]采用Red系统同源重组，对丝氨酸吸收系统进行多基因敲除，得到单基因敲除、双基因敲除及三基因敲除等11个突变菌株，成功考察了对大肠埃希菌产L-丝氨酸的影响。杨益等[10]通过设计长引物，PCR扩增出带有SAT1flipper的CaCsC1基因敲除盒，对 Red两步同源重组法加以延伸，成功得到敲除了两个等位基因的白念珠菌CaCsC1基因缺失株。与传统的白念珠菌基因敲除方法相比较不需要构建克隆载体，比较简单，用FRT序列替代靶基因，没有NAT抗性，从而减少外源基因的插入对菌株造成的影响。总的来说，应用Red同源重组策略主要有四种[11]：①一次筛选：即两侧为同源臂中间为筛选标记基因的DNA片段与染色体上的靶基因发生同源重组，筛选标记基因取代靶基因，标记基因留在染色体上；②一次筛选，一次位点专一性重组：这种Red同源重组策略是在一次筛选的基础上，利用位点特异性重组酶系统去除筛选标记基因，来源于F1噬菌体的cre/loxP系统就可以介导位点特异性DNA重组，此外还有Ftp/FRT重组系统。Tamakawa等[12]通过cre-loxP系统重组法成功对C.utilis基因(CuPDC)进行了敲除。cre-loxP系统主要应用于多倍体的敲除，尤其是在食品酵母基因无痕敲除方面的应用[13]；③一次筛选，一次限制性核酸酶酶切：这种技术也可以将标记基因去除，同时还可以留下一个限制性酶切位点。王立东等[14]在研究乙醛脱氢酶基因对明串珠菌产甘露醇影响时，首先构建了携带四环素抗性基因的同源重组载体，然后利用限制性内切酶EcoRI酶切去除抗性标记基因，产生无抗性标记上的同源重组载体，最终获得乙醛脱氢酶基因敲除突变菌株；④两次筛选：构建的基因置换载体有两个筛选标记基因，通常为一个抗性基因，一个致死基因，如sacB有时也称为反向筛选标记基因。

1.3 基于自杀载体的同源重组法

所谓自杀质粒(suicide plasmid)就是指当某一特定质粒进入宿主细胞时，要么整合到宿主染色体上，要么因为不能复制而被消除掉，这是因为自杀质粒的复制需要一种特殊的蛋白质，如果宿主不能够产生这种蛋白质，除非整合到染色体上，那么就不能继续存在，这就是自杀质粒用来作为基因敲除工具的理论基础。因此，不同的微生物需要选择不同的自杀质粒，在目的菌株中自杀质粒迫于生存的需要，会促使自身与染色体发生整合，利用一定的方法，将含有目的基因同源臂的DNA片段克隆至自杀载体，这个自杀载体上通常需要两个筛选标记，一个正筛选标记，一个负筛选标记，当含有同源臂的自杀载体导入目的菌株时，在生存压力下，自杀载体会与染色体DNA发生同源重组，即发生第一轮单交换，而后在负筛选的压力下发生第二轮的单交换，最终将基因敲除[15]。常见的自杀载体有pK18mob、pCVD442、pSVP202、pKSV7、pEX18Tc等，各种自杀质粒实现自杀的原理不尽相同，如pCVD442是因为大多数宿主菌体无法产生π蛋白。而自杀质粒pKSV7同时也是温敏型质粒。刘武康等[16]利用温敏型自杀载体pKSV7构建重组质粒，将单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)这一胞内寄生菌的毒力因子内化素A(internalinA,InlA)和内化素B(internalinB,InlB)基因进行敲除，成功研究了双基因缺失突变菌株的基本生物学特性。林丹枫等[17]以自杀型质粒pSVP202为载体，成功构建基因置换质粒，敲除类球红细菌的八氢番茄素合成基因crtB，并引入大肠埃希菌的4-羟苯甲酸转移酶基因ubiA和分支酸裂解酶基因ubiC，提高了类球红细菌中辅酶Q10的产量。韩武洋等[18]利用自杀载体pKB18mobsacB，采用无抗性标记的同源重组法，成功敲除了野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC10332中编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH、ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和ioltl，构建了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌。

1.4 基于温敏型质粒的同源重组法

温敏型质粒是一种含有温度敏感型复制子的质粒，它在高温条件下无法复制，在高于37 ℃时会自动去除。比如常见的用于基因敲除的pKC1139、pKD46、pBV220就是温敏型质粒，pKD46含有oriR101温度敏感型复制元。当带有目的菌株同源基因的温敏型质粒进入宿主菌株时，在高温条件下，温敏型质粒迫于生存的压力，就会与宿主染色体上的同源序列发生同源重组，利用温敏型质粒的这一特性来对菌株上的目的基因进行敲除，大大提高了成功的概率。四种敲除方法的比较见图1。段雪梅等[19]利用温敏型质粒pKC1139构建重组质粒pKT7074，在40 ℃高温下，迫于生存压力重组质粒pKT7074成功整合到染色体上，取代了靶基因，构建出生防菌Act12转录调控因子SPA7074缺失突变株。陈晖等[20]以生产氨甲酰卡那霉素B工程菌株黑暗链霉菌S.tenebrarius312为出发菌株，同样利用温敏型穿梭质粒pKC1139，构建重组质粒pBZ2，敲除氨甲酰磷酸转移酶基因tobZ，得到生产卡那霉素B的工程菌ST314。

1.5 CRISPR/Cas系统介导的基因敲除方法

规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是在长期进化过程中形成的一种免疫防御系统，用于抵御外源DNA的入侵[21]，广泛存在于古细菌和细菌中，是近年来研究的热点。可以利用这个系统进行基因敲除，关于CRISPR的研究开始于1987年，日本研究人员从大肠埃希菌中发现长29 bp、间隔32 bp的重复序列[22]。这一发现并没有得到足够重视，经过十几年，随着越来越多微生物基因组测序工作的完成，人们发现在许多细菌和古细菌中都存在这样的重复序列。2002年荷兰研究者将这些高度同源的间隔重复序列命名为CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，并发现了与CRISPR相关的基因，即Cas9基因[23-24]。2005年发现CRISPR间隔序列基因与噬菌体和其他外源DNA序列同源，推测间隔序列与生物体抵抗外来入侵有关[25]，2007年通过实验证明了这一猜想，即CRISPR系统具有免疫防御功能[26]。随后经过许多研究者的不懈努力，CRISPR系统的作用机制与原理逐步被发现，并将其应用到基因编辑技术中，在线虫、人类细胞、水稻、拟南芥、斑马鱼、果蝇、酿酒酵母等方面都有应用。CRISPR系统介导的基因编辑技术较其他方法具有编辑效率高、靶向性强、操作简单等优势，当然也存在不足的地方，如脱靶效应，在一定程度上限制了其广泛应用[27]，同时也得到越来越多研究者的重视。

目前根据Cas9蛋白的不同将CRISPR系统主要分为三种类型，分别为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ[28],每一类型又分为多种亚型,这从另一方面也说明了CRISPR系统的多态性[29]。TypeⅠ的CRISPR系统在细菌与古细菌中都有存在，具有独特的Cas3蛋白，在三种类型中最为简单的是TypeⅡ的CRISPR系统，但只存在于细菌中，特有Cas9蛋白，Cas蛋白最少，是进行基因编辑时最常利用的类型,具体结构如图2。TypeⅢ的CRISPR系统大多在古细菌中发现，少量发现于细菌中，含有功能尚不明确的Cas10蛋白与Cas6蛋白，这三种类型的Cas蛋白在抵御外来入侵时各自发挥着独特的功能[30]。CRISPR系统之所以能够应用于基因编辑技术中，是因为它能够通过引导RNA特异性切割靶序列。2013年通过将CRISPR系统应用于人类和小鼠胚胎干细胞中，实现了多基因的敲除，提高了基因敲除效率[31-32]。

图2 CRISPR/Cas9系统结构Fig.2 CRISPR/Cas9 system structure

2 发明专利

基因打靶技术应用于生物界的所有领域，在动物学、植物学、微生物学方面都有巨大的应用价值。基因敲除相关研究十分热门，吸引了很多研究者，得到了许多研究成果及发明专利，这里对微生物方面最新相关专利方法做一介绍。丁承超等[33]发明了一种敲除减毒单核细胞增生性李斯特氏菌两个毒力因子actA和inlB的方法，使减毒后的单核细胞增生李斯特氏菌作为疫苗的载体，从而研究LM食源性致病菌的致病机理，该方法的大致步骤：首先设计引物，利用PCR扩增出actA基因的上下游片段，然后使用限制性内切酶进行酶切，采用T4DNA连接酶将酶切后的上下游片段连接，同样使用限制性内切酶将连接好的片段与穿梭质粒pKSV7再次进行酶切，T4DNA连接酶再次连接，最后得到重组质粒载体，将其导入大肠埃希菌DH5α中，与此同时，要将空质粒pKSV7导入大肠埃希菌中作为对照。单核细胞增生李斯特氏菌可引起多种疾病，可以穿越血脑、胎盘屏障，对环境的耐受能力极强，已引起全世界范围内的关注，成为基因工程疫苗的研究热点问题，该发明存在显著的进步性，敲除了单核细胞增生性李斯特氏菌的两个毒力因子，使其减毒，可以作为疫苗载体。王瑞明等[34]发明了一种地衣芽胞杆菌基因快速敲除的方法，整个过程分为四步，首先获取地衣芽胞杆菌目的基因中一段编码基因，将其作为同源臂，获取抗性标记基因，这是必不可少的，经过重叠PCR技术，可以将目的基因同源臂序列和抗性标记基因融合在一起，然后进行单酶切，最后转化到目的菌株，即感受态地衣芽胞杆菌，经过一定的培养，得到基因缺失的地衣芽胞杆菌。以前对地衣芽胞杆菌敲除基因时，通常是构建两端基因上下游同源臂中间抗性标记基因的置换质粒，进行同源双交换，这种方法是基于单交换原理，只需进行一次同源重组即可，相比较一般的基因敲除技术，操作简单，周期较短，敲除效率高，存在很大的进步意义。刘龙等[35]发明了一种敲除黑曲霉基因的方法，该方法将基因敲除元件与剪切元件都整合到黑曲霉基因组中，只需进行一次转化，在诱导型启动子的诱导下就能消除抗性基因，该发明提供了新的方法与思路，可以进行多个基因的敲除。于慧敏等[36]利用重组自杀质粒转化酰胺酶基因缺失红球菌的感受态细胞，得到红球菌双基因敲除突变株，公开了一种红球菌双基因敲除及高表达腈水解酶的构建方法。江福能等[37]利用最近研究较多的CRISPR/Cas9基因敲除技术发明了一种miR-205基因敲除试剂盒，此外还有一些基因敲除发明专利较其他方法都存在显著优点。

3 展 望

基因敲除技术是一种重要的基因修饰技术，在各种微生物基因已经测定的条件下，对各个基因序列功能的研究就显得尤为重要，基因敲除技术为研究基因组的功能提供了可能，通过对目的菌株某个基因的敲除，考察该基因对目的菌株的作用。基因敲除技术的功能在于可以通过构建合适的载体选择性地修饰基因，进而可以控制基因的表达，了解基因的独特功能，进一步得到人们所需要的产物。基因敲除技术在改造动植物、微生物基因组、研究发育生物学、鉴定新基因新功能、育种以及医疗领域都有应用价值，并取得了很大进展，基因敲除技术为了解基因组的功能提供了有效的工具，为科学领域的研究带来一个又一个新的突破，相信在不久的将来，更多新的基因敲除方法将被发明，现有方法的不足将得到提高与完善，基因敲除操作将变得越来越容易。