氢氧化细菌SDW-16的分离鉴定及促生特性

王 琳，李志英，常小娟，刘 欣，王卫卫

(1.西安医学院 医学技术系，陕西 西安 710021；2.西部生物资源与现代生物技术教育部重点实验室，陕西 西安 710069)

定殖于植物根际的根际促生菌的促生机制有直接和间接两种方式[1]。直接促进作用包括固氮作用，产生植物生长激素，分泌铁载体，合成ACC脱氨酶、溶磷等[2-4]；间接促进作用包括产生抗生素，与病原菌竞争根际有限的营养与空间，抑制根际病原菌的生长，增强植物抗病能力[1]。鉴于植物根际促生菌在农业生产领域的巨大应用潜力，优势植物根际促生菌的分离鉴定已成为非常有价值的一项工作。豆科作物的轮作、间作效益多被归功于豆科作物根部根瘤菌的固氮作用，而已有研究表明氮肥不能完全取代豆科作物的轮作效果，大约75%的增产效益还不能用现有理论解释[5]。因此，Dong等[6]的研究表明根瘤菌在固氮过程中释放的氢气促进根际氢氧化细菌的生长，氢氧化细菌通过某些方式促进植物生长。但是，豆科植物根际的氢氧化细菌不易分离，导致其研究工作不充分，把氢氧化细菌作为一类植物根际促生菌，并进一步分析其促生特征的研究鲜有报道。本研究利用气体循环培养体系从豆科植物沙打旺根际土壤中分离氢氧化细菌，并分析其分泌吲哚乙酸(IAA)、分泌铁载体、合成ACC脱氨酶等促生特征，最后根据16S rDNA序列分析和相关生理生化特征进行分类鉴定，发现有较高研究价值的菌株，拓展人们对氢氧化细菌分类地位的认识，并初步探究氢氧化细菌的促生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样的采集 从西北大学果园中选1株生长旺盛的沙打旺连根拔起，把附着在根部根瘤上的土轻轻转移到取样袋中，迅速保存于4 ℃环境。

1.1.2 培养基 ①MSA无机盐培养基：K2HPO42.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 5.0 g，(NH4)2SO45.0 g，MgSO40.2 g，CaCl20.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1 000 mL，琼脂16 g，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min；②KingB-Trp培养基：蛋白胨20 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，甘油15 mL，L-Trp 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；③DF基本培养基：葡萄糖2.0 g，D-葡萄糖酸4.0 mL，柠檬酸2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO44.0 g ，Na2HPO46.0 g，微量元素1.0 mL(FeSO4·7H2O 1.0 mg，H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，MnO310 mg，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2)。

1.2 方法

1.2.1 氢氧化细菌的分离筛选 取10 g土样转移到装有90 mL无菌水的锥形瓶中，180 r/min、30 min摇匀后，从锥形瓶中吸取0.1 mL上层悬浮液加到0.9 mL无菌水中混匀，并作一系列10倍梯度的稀释，最终稀释倍数为10-12。从每个梯度中取0.1 mL菌液于MSA无机盐平板培养基上稀释涂布，每个梯度设置3个重复。平板在连续通氢装置(通过电解水产生氢气，浓度为4.16×10-4～2.42×10-3mol/L)中30 ℃培养7 d。

1.2.2 细菌形态特征和生理生化特征鉴定 细菌的形态学特征鉴定参照《微生物学实验》[7]，生理生化特征鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]。

1.2.3 16S rDNA序列测定 接种环挑取纯化的单菌落悬浮于装有500 μL超纯水的离心管中，沸水浴10 min，立即冰浴5 min，然后离心(12 000 r/min、10 min)，上清液即为模板DNA。上清液转移到无菌的1.5 mL离心管中备用。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)用于细菌16S rDNA的扩增。每10 μL PCR体系包括：模板0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，2×Taqmaster Mix 5 μL，dd H2O 3.8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 min，33个循环；72 ℃终止延伸10 min。扩增完成后将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和测序。

1.2.4 系统发育树的构建 将得到的16S rDNA序列录入NCBI网站，与已知序列比对并分析同源性。用MEGA 5.05软件将各序列对位排列，适当人工校正后以邻接(Neighbor-joining)法和Kimura 2参数模型建立系统发育树。

1.2.5 吲哚乙酸(IAA)检测 将待测菌株接种于5 mL LB液体培养基中，28 ℃，180 r/min摇床培养，24 h。取1.0 mL菌液以5 000 r/min离心10 min后弃上清，无菌水洗涤2次后稀释10倍。取上述菌悬液0.1 mL(约10-7cfu/mL)接种到50 mL KingB-Trp培养基，30 ℃，180 r/min摇床避光培养72 h，每株菌3个重复。IAA含量测定根据Salkowski法[9]。将培养液10 000 r/min离心10 min后，取上清液1.0 mL加入避光的冻存管中与1.0 mL Salkowski试剂(1.015 g FeCl3·6H2O，150 mL H2SO4，250 mL ddH2O)混匀，室温下放置20 min。然后在530 nm波长下测定吸光度。IAA浓度计算参照IAA标准曲线(浓度10～100 μg/mL)。

1.2.6 ACC脱氨酶活性检测 ①ACC脱氨酶阳性菌株的筛选：筛选依据是菌株能否在以ACC为惟一氮源的平板上生长。待测菌株分别接种到无氮的DF基本培养基和添加3.0 mmol ACC为惟一氮源的DF基本培养基，30 ℃培养3 d。不能在无氮源的DF基本培养基上生长，能在添加3.0 mmol ACC为惟一氮源的DF基本培养基上生长的细菌则初步鉴定为含有ACC脱氨酶。②ACC脱氨酶活性检测：茚三酮比色法检测菌株酶活力。首先分别取10、50、100、200、300、400、500 μg/mL ACC溶液各5 mL分别置于50 mL比色管中，再向其中加入1 mL 0.5%的茚三酮试剂，充分摇匀。90 ℃水浴25 min后冷却至室温，用721型分光光度计在570 nm下测得其光密度值。以标准液的光密度值和浓度做标准曲线。将筛选的菌株接种到含0.5 g/L的ACC检测培养基中28 ℃、180 r/min培养24 h。培养液10 000 r/min，4 ℃离心30 s取上清液。以同样的反应量与反应条件进行反应，并在570 nm条件下测定其吸光值。

1.2.7 铁载体检测 细菌分泌铁载体能力的检测参照CAS(Chrom-Azurol Siderophore)平板法[10]。平板颜色从蓝色变为桔黄色，则认为有铁载体产生。

2 结果与分析

2.1 菌株SDW-16的获得

根据氢氧化细菌独特的代谢特点，选取不含碳源的MSA无机盐培养基分离筛选氢氧化细菌，在H2、CO2、O2组成的混合气体中，只有氢氧化细菌能以H2为能源，CO2为碳源进行化能自养生长。在MSA无机盐固体平板上30 ℃培养7 d后，从平板上挑取不同形态的单菌落进一步划线纯化，得到11株氢氧化细菌。以平板培养筛选自养能力强的菌株，得到菌株SDW-16。

2.2 菌株SDW-16的形态特征和生理生化特征

菌株SDW-16为杆状，大小为(0.6～0.8 )μm×(2.0～2.5)μm，革兰染色阴性。在MSA无机盐固体平板上30 ℃培养7 d后形成1 mm左右的菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘整齐，表面光滑，其生理生化特征见表1。

2.3 16S rDNA序列分析

菌株SDW-16的16S rDNA片段长度为1 526 bp，GenBank登录号为KF835389。16S rDNA序列扩增结果见图1。SDW-16 16S rDNA序列为基础构建的系统发育树得出，SDW-16菌株与荧光假单胞菌在系统发育树上位于相同的发育分支(图2)，且同源性为99%，同时结合生理生化特征，鉴定菌株SDW-16为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

表1 菌株SDW-16的生理特征Table 1 Physiological characteristics of strain SDW-16

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

图1 菌株SDW-16 16S rDNA序列扩增结果Fig.1 Amplification of strain SDW-16 16S rDNA sequenceM：Marker；1：SDW-16

2.4 菌株SDW-16的吲哚乙酸(IAA)含量

有些植物根际促生菌能分泌IAA促进植物根的生长发育，对植物生长产生积极的影响[11]。在KingB-TrP培养基培养72 h后，菌株SDW-16产生IAA的量为(21.62±0.30)μg/mL，达到较高水平。

2.5 菌株SDW-16的ACC脱氨酶活性

细菌不能在无氮源的DF基本培养基上生长，能在添加3.0 mmol ACC为惟一氮源的DF基本培养基上生长则认为具有ACC脱氨酶活性，对符合此特征菌株SDW-16的ACC脱氨酶活性高达(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)。

2.6 菌株SDW-16的铁载体

在铁缺乏的条件下对菌株SDW-16进行铁载体检测，结果显示接种有SDW-16的CAS检测平板在3 d后从蓝色变为桔黄色(图3)，证明菌株SDW-16具有产生铁载体的能力。

图2 以菌株SDW-16 16S rDNA序列为基础构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on strain SDW-16 16S rDNA sequence

图3 菌株产铁载体Fig.3 Iron carrier map of strain

3 讨 论

植物根际促生菌不但可以促进植物生长，而且可以减少因使用传统化学肥料造成的环境污染，在世界上一些地区的实际应用中取得了良好的效果，鉴于植物根际促生菌在农业生产中的巨大应用潜力，其研究在国际上越来越受重视。目前已知的植物根际促生菌种类主要包括芽胞杆菌属(Bacillus)、固氮菌属(Azotobacter)、黄杆菌属(Flavobacteria)、哈夫尼菌属(Hafnia)、固氮螺菌属(Azospirillum)、欧文氏菌属(Erwinia)、慢生型根瘤菌属(Bradyrhizobium)、肠杆菌属(Enterobacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、节杆菌属(Arthrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和假单胞菌属(Pseudomonas)等[12-14]。

Mclean等[15]和Dong等[16]的研究证实氢氧化细菌也属于一类根际促生菌，而且通过大田试验和实际农业生产应用也证实了氢氧化细菌的促生能力。氢氧化细菌独特的代谢特点使其成为根际促生菌家族中的独特种群，豆科植物多为重要的经济作物，其根瘤附近的富氢环境也非常适合氢氧化细菌生长，因此我们从沙打旺根际土壤中分离有潜在促生价值的菌株。鉴于氢氧化细菌独特的代谢特点，本研究利用不含碳源的MSA无机盐培养基对其进行分离培养，连续通氢装置可以模拟豆科植物根瘤附近的富氢环境。

植物在遭遇干旱、水灾和盐碱等逆境条件下会产生过量乙烯而不利于自身的生长发育。ACC脱氨酶能裂解乙烯的前体ACC为氨和a-丁酮酸，降低乙烯水平减轻乙烯对植物生长的不利影响，所以产生ACC脱氨酶是重要的促生机制之一。

菌株SDW-16的ACC脱氨酶活性高达(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)，远高于AS(1 116 nmol/(mg·h))和CS(1 002 nmol/(mg·h))两株菌[17]；高于68%的ACC脱氨酶阳性株菌，与该文中菌株YsS3(8 580 nmol/(mg·h))和YsS2(9 880 nmol/(mg·h))的酶活性相当[18]。研究表明这些菌株都能产生明显的促生效果，关于ACC脱氨酶活性，SDW-16高于或达到其他植物根际促生菌，可见菌株SDW-16也具有较大促生潜力。

植物激素吲哚乙酸(IAA)是调节植物生长发育的主要激素，在促进植物生长发育中起重要作用。本研究中菌株SDW-16产生IAA的量为(21.62±0.30)μg/mL，高于63.6%的IAA阳性菌株[19]。对菌株SDW-16培养72 h后测定IAA含量，因为此时细菌处于稳定期，培养液中IAA含量水平最高。IAA见光易分解的特性要求在实验过程中要采取避光措施，减少对试验结果的影响。

铁载体是细菌在铁缺乏环境中分泌的一种对Fe3+有很强特异螯合作用的低分子量化合物，在铁胁迫环境中植物根际细菌可以分泌铁载体螯合周围的Fe3+促进自身生长，同时还能抑制有害病原菌吸收Fe3+，从而增强植物的抗病性。CAS 检测平板由蓝色变为桔黄色，表明菌株SDW-16具有分泌铁载体的能力。

基于16S rDNA序列及相关生理生化特征，菌株SDW-16 被鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。荧光假单胞菌是一种重要的植物根际促生菌，相比其他根际促生菌具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强等特点。其中一些菌株还可用于植物病害防治，如水稻鞘腐病(Sarocladiumoryzae)、小麦根腐病(Pythiumspp.)、棉花碎倒病(Pythiumultimum)、棉花立枯病(Rhizoctonaisolani)、烟草黑胫病(Phtophthoraparasiticavar.nicotianae)等[20]。促生特征分析表明，SDW-16具有多项植物根际促生菌具备的重要促生特征，且分泌IAA和ACC脱氨酶的能力均达到较高水平，尤其是其ACC脱氨酶活力高达(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)，研究表明[21-22]，菌株的促生能力与其ACC脱氨酶活力呈显著正相关性。

SDW-16是1株具有较大促生潜力和较高研究价值的菌株，后续要开展其实际促生效果(盆栽或田间试验)的研究，争取将其应用于实际农业生产中。菌株SDW-16的发现不但丰富了人们对氢氧化细菌分类地位的认识，而且增加了优势根际促生菌的菌种资源。