TLR7激动剂对P.y 17XNL感染BALB/c小鼠免疫调节效应的影响

邱 悦，赵永红，曹雅明*

(1.中国医科大学附属第一医院 心血管超声科，辽宁 沈阳 110001；2.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122)

疟疾是热带和亚热带地区最常见的寄生原虫感染性疾病。多项研究表明，宿主抗疟保护性免疫应答的水平和强度与疟疾预后显著相关，因此免疫细胞的数量和活化强度在其中发挥重要作用[1-2]。树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是唯一能够活化初始T细胞的专职抗原提呈细胞，也是连接固有和适应性免疫应答的桥梁[3-4]。疟原虫感染宿主后，DC依赖TLRs(Toll-like receptors)、MyD88和NF-κB的系列信号传导过程而活化[5]。其中，TLRs受体在免疫应答中可调控细胞因子、趋化因子、防御素等效应分子产生、调节抗原提呈细胞的抗原提呈能力，进而调控获得性免疫应答的强度和时程。当疟原虫侵袭宿主时，TLRs向机体传达病原体入侵信息，激活免疫系统。在疟疾感染过程中，TLR7识别疟原虫RNA[6]，继而通过MyD88传递活化信号，激活转录因子NF-κB，促进多种促炎性细胞分化，激活体液和/或细胞免疫应答[7]。同时，TLR7的激活可活化DCs，上调其表面共刺激分子和MHC-II类分子的表达水平，并抑制DC凋亡[8]。目前已明确证实，DC实现对T细胞的激活效应主要取决于TLRs的存在[3]。同时，DC是决定辅助性T细胞(T helper cells，Th)应答形式、强度和效应的关键因素[4]。Th1、Th2、Tfh细胞能够有效遏制疟原虫感染,它们分别在疟疾感染不同阶段发挥效应。其中，感染早期建立的Th1型细胞免疫应答可显著提高吞噬细胞的吞噬能力和杀伤活性[9]，控制疟原虫的指数性增殖，随后活化的Tfh和Th2细胞可以辅助B细胞活化、成熟增殖并产生特异性抗体，并有效清除疟原虫感染[10]，Treg在平衡Th1/Th2免疫应答过程中发挥重要作用[11]。本研究采用约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XNL，P.y17XNL)感染BALB/c小鼠，观察TLR7激动剂对疟疾感染早期DCs亚群，CD4+T细胞及其亚群的活化状况、应答模式，明确TLR7介导DC调控免疫的作用机制，以期为研制开发有效的疟疾疫苗提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和鼠疟原虫株来源 雌性6～8周龄SPF级BALB/c小鼠，购自中国医科大学实验动物部；非致死型约氏疟原虫P.y17XNL，为本实验室长期传代保存。

1.1.2 主要试剂 FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体(clone 2.4G2);FITC-anti-CD11c(clone HL3)；PE-anti-CD11b(clone H1.2F3)；PE-anti-CD86(clone GL1)；PerCP-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2)；FITC-anti-CD4(clone GK1.5)；PE-anti-TLR7(Clone A94B10)；APC-anti-MHC II(clone M5/114.15.2)；APC-anti-T-bet(clone 39D)；FITC-anti-IFN-γ(clone XMG1.2)；PE-anti-GATA3(clone L50-823)；PE-anti-CXCR5(Clone 51505)；PE-anti-CD25(clone 7D4)；PerCP-CyTM5.5 anti-Foxp3(clone 17-5773-80)。以上试剂均购自BD Biosciences公司；ELISA试剂盒购自R&D；TLR7激动剂Loxoribine(Sigma，USA)；PMA、Ionomycin和BFA购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器与设备 iMark microplate Reader 酶标仪(BIO-RAD，美国)；FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验模型建立及处理 雌性6～8周龄BALB/c小鼠随机分为2组：P.y17XNL正常感染组(Control)和TLR7激动剂处理组(Loxoribine)。两组小鼠均通过腹腔注射1×106个非致死型约氏疟原虫P.y17XNL感染的红细胞，构建鼠疟模型。Loxoribine 组P.y17XNL感染前24 h，腹腔注射TLR7激动剂Loxoribine(1 mg/(0.1 mL·只))，对照组小鼠注射同等剂量的PBS。

1.2.2 观察小鼠的感染率 感染后不同时间点，尾静脉采血并制备单层血细胞薄片。在感染后不同时间点小鼠尾静脉采血，吉姆萨染色计数感染率。

1.2.3 脾细胞流式细胞术 参照文献的检测方法[12]，分别于感染后第5天和第10天取小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，取1×106裂解红细胞后的脾细胞加入流式管中，采用100 μL PBS重悬细胞。分别采用以下荧光抗体标记不同免疫细胞亚群：DC亚群(CD11c+CD11b+/CD45R/B220+)、TLR7及活化的DC(CD11c+MHC-II+TLR7+)、Tfh/Treg(CD4+CXCR5+/CD4+CD25+FoxP3+)。为检测Th1和Th2细胞，取1×106脾细胞悬于400 μL RPMI-1640中。加入刺激物PMA(50 ng/mL)、Ionomycin(1 μg/mL)和BFA(10 μg/mL)，并在37 ℃、5% CO2条件下刺激培养4.5 h后，采用PBS洗涤细胞2次，使用单克隆抗体标记Th1(CD4+T-bet+IFN-γ+)和Th2(CD4+GATA-3+IL-4+)。采用FACSCaliburTM细胞分析仪(BD Biosciences)进行流式细胞术检测，FlowJo软件分析检测结果。

1.2.4 ELISA检测 ELISA检测脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-21和IL-10的细胞因子水平，酶标仪测定450 nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro 4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.5 统计学分析 应用GraphPad Prism 6.0统计软件对数据进行分析，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异。P<0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 TLR7激动剂对疟原虫血症水平的影响

如图1所示，正常P.y17XNL感染组(Control)和TLR7激动剂(Loxoribine)组小鼠均于感染后第3天在外周血中出现感染的红细胞，随后持续升高，对照组小鼠的原虫血症于感染后第13天达到峰值(16.8%)，然后开始逐步下降，于第21天左右自然自愈；Loxoribine组于感染后第9天达到峰值(7%)，之后开始逐渐下降，于感染后第17天左右自然自愈。结果表明，外源性给予Loxoribine可显著降低小鼠虫血症水平。

图1 TLR7激动剂处理对P.y 17XNL感染BALB/c小鼠的原虫血症水平的影响Fig.1 The effect of TLR7 agonist treatment on the parasitemia of BALB/c mice infected with P.y 17XNL * P<0.05，** P<0.01

2.2 TLR7激动剂对感染小鼠DC亚群及其活化的影响

在P.y17XNL感染后第0、5和10天，通过FACS检测了两组小鼠脾细胞中DC亚群及相关功能分子的表达情况。结果表明，感染后第5、10天，Control组与Loxoribine处理组TLR7+DC(CD11c+TLR7+)的百分比较感染后第0天明显增加(P<0.05)(图2A)。P.y17XNL感染后第5天，与Control组相比，Loxoribine处理组总DC(CD11c+DCs+)、髓样DC(mDC，CD11c+CD11b+)浆样DC(pDC，CD11c+CD45R/B220+)的表达量均显著高于感染后第0天(P<0.05，图2B-D)。而感染后第10天，各组细胞亚群数目虽有所增高但无统计学差异(图2B-D)。P.y17XNL感染后第5天和第10天，对照组与实验组DC细胞亚群MHC-II+DC(CD11c+MHCII+)和CD86+DC(CD11c+CD86+)的表达量均高于感染后第0天，具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)，但实验组与对照组之间无明显差异(图2E和2F)。结果提示，Loxoribine处理会显著促进DC及其亚群的分化和活化。

2.3 TLR7激动剂对小鼠脾细胞中T细胞亚群分化的影响

通过FACS检测了TLR7激动剂对T细胞亚群(Th1、Th2、Tfh、Treg)的影响，结果如图3所示：在感染后第5天，P.y17XNL感染促进4种T细胞亚群的分化，与Control组相比，Loxoribine处理组的Th1细胞和Tfh细胞数量显著高于Control组(P<0.05，图3A和C)，但两组之间Th2细胞和Treg的数量无显著性差异。在感染后第10天，Loxoribine处理会促进Th1细胞、Th2细胞和Tfh细胞的升高(图3A～C)，但两组之间只有Th2细胞数量存在显著性差异(P<0.05)，Treg未见有显著变化。上述结果提示，TLR7激动剂促进宿主Th1、Th2和Tfh细胞的分化。

2.4 TLR7激动剂对小鼠脾细胞中T细胞活化的影响

为探讨TLR7激动剂对T细胞免疫功能的影响，通过ELISA检测脾细胞培养上清中各细胞亚群特异性细胞因子的表达水平。如图4所示，P.y17XNL感染促进IFN-γ、IL-4、IL-21和IL-10的升高。在感染后第5天，TLR7激动剂处理能够显著提高脾细胞上清中IFN-γ的水平(P<0.01，图4A)，同时也显著抑制IL-10的水平(P<0.01，图4D)，两组之间IL-4和IL-21未见显著性差异。在感染后第10天，两组之间的IFN-γ、IL-4和IL-10存在显著性差异(P<0.05或P<0.01，图4A、B、D)，IL-21未见有显著性差异。这些结果提示TLR7激动剂可促进Th1细胞活化，抑制Th2细胞和Treg的功能，但对Tfh细胞功能没有显著影响。

图2 TLR7激动剂对感染小鼠脾脏中DC亚群及其功能分子的影响Fig.2 The effect of TLR7 agonist on the DC subsets and related functional molecules in the spleen of infected mice A：表达TLR7的DC数量；B：DC总数；C：髓样DC数量；D：浆样DC数量；E：表达MHC II类分子的DC数量；F：表达CD86分子的DC数量；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05A:DCs expressing TLR7;B:total DCs;C:myeloid DCs;D:plasmacytoid DCs;E:DCs expressing MHC II;F:DCs expressing CD86

图3 TLR7激动剂对感染小鼠脾脏中T细胞亚群分化的影响Fig.3 The effect of TLR7 agonist on the T cells subpopulations differentiation in the spleen of infected mice A：Th1细胞数量；B：Th2细胞数量；C：滤泡辅助性T细胞数量；D：调节性T细胞数量；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05A:Th1 cells;B:Th2 cells;C:Follicular helper T cell;D:Regulatory T cells

图4 TLR7激动剂对感染小鼠脾细胞培养上清中T细胞细胞因子的影响Fig.4 The effect of TLR7 agonist on the cytokine's levels of T cells in the cultured supernatant of spleen cells from the infected mice A：IFN-γ水平；B：IL-4水平；C：IL-21水平；D：IL-10水平；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05，## P<0.01A:The level of IFN-γ;B:The level of IL-4;C:The level of IL-21;D：The level of IL-10

3 讨 论

固有免疫系统是机体抵御外来感染的第一道屏障。TLRs是固有免疫启动免疫效应的识别受体。既往研究证明TLRs受体参与疟疾感染的过程。其中，TLR7识别疟原虫RNA，主要表达于pDC[4，13]。TLR7被其配体激活后，通过下游接头蛋白分子MyD88将激活信号向下游传递，最终激活转录因子NF-κB，从而产生多种细胞因子，参与体液免疫或细胞免疫应答。目前TLRs激动剂可能成为理想的疫苗佐剂，比如TLR9、TLR4激动剂已开始应用[14-15]。本研究通过建立约氏疟原虫感染BALB/c小鼠模型，并给予TLR7激动剂，观察其如何启动并影响免疫应答，这将为研究新的疫苗提供参考。

DC作为固有免疫细胞之一，是目前研究发现的功能最强、也是唯一能够活化初始型T细胞的专职抗原提呈细胞。在连接固有免疫和适应性免疫中起到关键作用。通过表面相关模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别并处理病原体抗原是DC发挥生物学效应的前提[16]。本研究结果显示，TLR7激动剂可以活化DC，尤其是表达TLR7的 DC，从而促进DC亚群的分化。

DC活化后会启动宿主适应性免疫应答来控制疟疾感染，其中Th1细胞免疫应答的强度对疟疾感染预后至关重要[17-18]。本研究结果显示，TLR7激动剂Loxoribine能够显著促进感染早期Th1和Tfh细胞分化，同时Th1细胞因子IFN-γ的表达水平也显著升高，Treg的数量未受影响，但其特异性的IL-10水平显著降低，这些结果表明TLR7激动剂促进感染早期Th1免疫应答来控制疟原虫感染，从而缩短宿主自愈时间。

在P.y17XNL感染的BALB/c小鼠模型中，TLR7激动剂Loxoribine可通过诱导DC的活化，促进Th1型免疫应答，在感染早期发挥保护性免疫作用，降低原虫血症水平。本研究为有效的疟疾疫苗的研发和发明提供了参考。