雪峰虫草的研究现状、问题及展望

钟 灿，金 剑，刘 浩，蔡 媛，秦 优，谢 景，王维子，秦裕辉，黄惠勇，张水寒*

(1.湖南省中医药研究院 中药研究所，湖南 长沙 410013；2.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128；3.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208)

虫草是虫草真菌寄生于昆虫幼虫或者蛹上的虫菌复合体[1]，全世界虫草真菌约有 1 000 余种，隶属 3 个科 20 余属[2-3]。据粗略统计，我国目前共报道虫草约 100 余种[4-6]，其寄主昆虫共涉及昆虫纲Insecta 的 11 个目 100 余种[7]，其中 13 种虫草被列为药用真菌[8]，具有很好的药用价值。随着人们对健康养生的重视和虫草的药用保健价值认识的深入，虫草的产业化用量和优质虫草的市场需求急剧增加。目前青藏高原及周边海拔3 000 m以上地区生长的野生冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)占据虫草的主流市场，年采集量 100 t以上[9]，年总产值超过 300 亿。然而连年无序地采挖，使生态环境严重受损，造成菌源枯竭，虫草资源濒危，而冬虫夏草规模化人工培育还有诸多的技术难题尚未攻克。虫草是我国重要的药用真菌[10]，加强虫草类的研究，对今后开展相关药用真菌的研究具有重要的参考价值。模式虫草的深入研究和新型虫草的挖掘，已经成为近年来研究的热点。雪峰虫草(Ophiocordycepsxuefengensis)是近年来在湖南省雪峰山系发现的一种新的虫草资源，在洞口县民间替代冬虫夏草治疗癌症、咳嗽及提高免疫力等，已有上百年的应用。其与冬虫夏草亲缘关系最近[11]，而对环境条件要求不严格，易于实现人工栽培，这意味着雪峰虫草具有开发成冬虫夏草替代品的独特潜质，是值得深入研究的新虫草资源。本文主要以虫草生长习性、菌种及其选育、虫草复合体的培育、人工子实体的培育、化学成分以及药理作用等，系统总结近年来对雪峰虫草的研究进展，对比雪峰虫草、冬虫夏草和蛹虫草(Cordycepsmilitaris)之间的异同点，阐释雪峰虫草的资源特色。

1 生长习性

雪峰虫草与冬虫夏草的亲缘关系很近，同蛹虫草一样易于人工培养，但它们的寄主、形态、生态均不同(表1)。雪峰虫草多生于海拔 300～1 000 m的活体植物马鞭草科大青(ClerodendrumcyrtophyllumTurcz.)的根或茎中。主要分布于湖南省洞口县、武冈县、洪江市、溆浦县等雪峰山脉区。与其他虫草相比，雪峰虫草有三个显著特征：①它的寄主可能是已发现的虫草属真菌中最大的，幼虫大小(60～110)mm×(7～12)mm；②寄主是单一的巨疖蝙蛾幼虫，栖生在大青树茎或根内；③具有无不孕顶端[11],其生长环境和形态特征见图 1 。

图1 雪峰虫草生长环境及形态Fig.1 Growth environment and morphology of O. xuefengensisA：野生雪峰虫草；B：雪峰虫草生长环境；C：大青；D、E：生长在大青根茎中的雪峰虫草A:Natural O.xuefengensis；B:Growth environment；C:Clerodendrum cyrtophyllum Turcz；D,E:O.xuefengensis grew in the rhizome

2 菌种及其选育

虫草菌分离与纯化得到单一的菌种是实现人工培育的前提。从天然冬虫夏草上分离的已报道真菌名称多达 22 个[22]，认为冬虫夏草菌是复合种，即除了真正的冬虫夏草菌外，可能还包括其他隐含种和伴生种[9]，这可能与冬虫夏草难以培育子座，无法根据子座进行鉴别有关。而对于蛹虫草、广东虫草、蝉花虫草等易于培育子座的虫草来说，菌种分离与鉴定不存疑，雪峰虫草也如此。近年来，团队先后 10 余次赴洞口县采集野生雪峰虫草，并分离了 10 余株菌株，与冬虫夏草、蛹虫草等进行亲缘关系分析[23]，发现其培养最适温度为 20～25 ℃，湿度为 60%～80%，避光。且通过人工培育后其菌丝、子座外观形态和显微结构等与野生雪峰虫草基本一致。

针对野生虫草菌种在人工培育过程中容易丧失子座分化能力、稳定性差，以及虫草素、多糖等活性物质含量低等问题，科研人员以蛹虫草为模式菌种，对其分离复壮进行研究[24]，同时采用紫外诱变[25]、原生质体融合技术[26-28]、超声联合化学试剂复合诱变[29]、离子诱变[30]、基因工程技术[31]等技术手段用于菌种选育，并取得了一定的效果。我们也正尝试采用多种技术相结合方式选育优良菌株，为雪峰虫草人工规模化培育提供优势菌株。

3 人工培育现状

近年来，人工培养虫草已成为一个热点问题，特别是冬虫夏草人工培育还有诸多的技术难题尚未攻克。虫草的人工培育包括虫菌复合体、子座和发酵液等不同方式，虫草人工培养对虫草类真菌的科学研究和生产应用具有双重意义。

3.1 虫菌复合体的培育

虫菌复合体的培育一直以来备受虫草研究人员关注，我国从 20 世纪 70 年代开始虫草人工栽培技术的研究，全国先后有几十家科研院所和企业对冬虫夏草[32]、蛹虫草(桑蚕蛹、大麦虫蛹等)[33-35]、泰山虫草(CN.200510133720.6)等的人工培育进行研究。然而由于冬虫夏草价值高，是市场认可的主流产品，从菌种分离、幼虫养殖、侵染和出草等四个关键环节对冬虫夏草全人工培育进行了大量研究[36]。目前已掌握了冬虫夏草的人工培育的一些关键技术，但过低的侵染率和出草率制约着冬虫夏草人工培育的规模化生产。

笔者前期试图对雪峰虫草虫菌复合体的全人工培育进行研究，但对雪峰虫草的寄主巨疖蝙蛾生物学特性进行研究发现其生活史复杂，生长周期较长[37]，其寄主幼虫的培育还在继续探索，侵染和培养技术已相对较为成熟。

侵染过程包括幼虫的选择、消毒、侵染方法的选择和用菌量等。幼虫的选择常用龄期作为控制指标[38]，通过酒精[33]、升汞、臭氧水[39]或者紫外照射等方式消毒，用分生孢子[40]、菌液[41]或者孢子菌丝悬浮液等，通过表皮涂抹、喷雾、菌液浸泡、注射和喂食等方式进行侵染，大部分研究表明注射方法侵染效果最佳[41]，也有认为表皮涂抹和喷雾效果较好，而浸泡和喂食不能侵染[40]。

笔者将采挖的巨疖蝙蛾幼虫在无菌环境下饲养 30～50 d，排除野外感染杂菌和雪峰虫草菌的可能，以虫体直径和长度作为筛选指标，对侵染的关键指标和技术进行研究。结果发现，直径>6.0 mm，长度>7 cm的幼虫，用 75%酒精擦拭配合紫外消毒 20 min效果较好，在其头部以下 3～5 环之间注射 0.2～0.3 mL 菌丝体悬浮液，死亡率明显低于比其小的幼虫，而侵染率明显高于其他幼虫。幼虫成活率高达 95% 以上，污染率在 15% 以下，侵染率均在 65% 以上，最高可以达到 85%。

侵染后的幼虫出草与否，是虫草培育成功的关键。研究表明出草与温度、光照等相关[36，42]。笔者通过研究发现，优势菌种是出草的前提，前期分离纯化的 10 株(HCMA001～010)菌株，经过固体培养基培养后发现其中 6 株(HCMA001、003、005、008、009、010)子座形成能力较强，与其他 4 株对比发现，其侵染幼虫成功率和出草率更高。而出草的条件则主要与温度和光照相关，湿度影响不大。注射菌液后应放置在黑暗条件，7～10 ℃培养15～30 d，待菌丝布满虫体，体表有子座原基分化后，转入 20～25 ℃、0～250 lux的弱光中继续培育待子座成熟，雪峰虫草虫菌复合体的人工培育见图 2 ，相关成果已申请了国家发明专利(专利申请号201611187730.2)。

图2 雪峰虫草虫菌复合体的人工培育Fig.2 Artificial cultivation of O. xuefengensisA：雪峰虫草菌液体发酵；B～D：人工培育雪峰虫草虫菌复合体A:Mycelial liquid culture；B-D:Cultivation of fungus-caterpillar complex

3.2 人工子座的培育

虫菌复合体的人工培育存在诸多难点，限制了其规模化发展，因此科研工作者在探索更为合理、有效的培养方式。日本清水大典报道称1932 年，小林义雄等首次在米饭培养基上成功获得蛹虫草子座，诸多学者开展了人工培养基培养虫草子座的探索[44-46]，取得了不错的成果，目前已经实现规模化生产，并被开发成多样产品。

笔者充分总结蛹虫草子座人工培育的经验和成果，根据雪峰虫草的生长习性，对雪峰虫草子座的培养基和培养条件进行优化，结果发现蚕蛹粉是子座形成和生长的必要条件，并控制大米∶蚕蛹粉为(15～20)∶(3～5)，添加的营养液是大米的 3～4 倍量，培养基过干或者过湿都会影响子座原基分化和生长量，而培养基中其他营养物质的添加，如蛋白胨和牛肉膏等氮源，葡萄糖和蔗糖等碳源，以及微量元素或者维生素等对其子座分化和生长影响较小。

适宜温度和避光培养条件是子座原基分化和生长的关键环境因子。温度和光照控制根据雪峰虫草的生长三个不同阶段进行调控。接种后菌丝生长期间适宜在 20～25 ℃避光培育至菌丝布满培养基表层；再转移至 5～10 ℃、12 h /20～25 ℃、12 h变温条件下，避光培养至子座原基分化；转入 20～25 ℃、0～250 lux弱光培养，至子座长到 8～12 cm，即可采收。雪峰虫草子座的人工培育见图 3 。子座圆柱形，生长末端为米白色，生长过程中子座外壁逐渐转变成黄褐色，直径为 1～4 mm，长度 45～150 mm，与天然雪峰虫草子座一致[11，47]。相关成果已申请了国家发明专利(专利申请号201611187284.5)。

3.3 雪峰虫草菌丝体的培养

虫草菌丝体发酵液的人工培养容易成功，对环境条件要求不高，菌丝发酵液主要用于次生代谢产物富集和相关菌丝体产品的研究，加速了虫草产业化进程[48-50]。冬虫夏草菌丝体的深层液体发酵已经较为成熟，已有基于液体发酵的菌丝体产品上市，例如百令胶囊、天狮虫草菌丝体胶囊等。目前雪峰虫草的液体发酵受设备等限制[51]，还没有大规模工业化应用，大多只是在实验室进行简易摇瓶发酵，用于雪峰虫草子座和虫菌复合体人工培养的菌液制备。笔者前期在 2 L 发酵罐中进行了雪峰虫草菌丝体发酵培养，基于HPLC-Q-TOF-MS/MS对主要核苷类物质进行了分析。通过发酵菌丝体与野生雪峰虫草对比，发现两者的核苷类物质差异不大，发酵菌丝体可作为一种野生雪峰虫草的替代开发产品[23]。刘莎等[52]利用液态发酵技术对雪峰虫草菌丝体进行培养，发现雪峰虫草可在液态发酵体系高效积累代谢产物，通过发酵过程优化控制,可实现该菌株细胞生长和活性代谢产物合成的优化。液体深层发酵易于控制菌丝体培养条件，易于规模化放大和工业化生产。类似抗生素生产的发酵工艺技术已经成熟，可见，液体深层发酵也是雪峰虫草培养的一个发展方向。

图3 雪峰虫草子座的人工培育Fig.3 Stromata artificial cultivation of O. xuefengensisA：子座原基；B～C：人工培育子座A:Stromata primordium inducing；B-C:Growth of stromata

4 化学成分研究

虫草的化学成分包括核苷类、多肽类、多糖类、甾醇和糖醇类、凝集素、纤维蛋白溶解酶类、黄酮类、维生素类、类胡萝卜素等[38,53]，而虫草多糖和虫草素被认为是虫草中最有药用价值的成分[38]。张水寒等[54]采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对野生雪峰虫草醇提物进行分析，共鉴定了 28 个化合物，主要包括甘露醇、腺苷、麦角甾醇、谷甾醇、氨基酸、脂肪酸和糖类等成分。宛玉祥等[55]采用GC-MS技术鉴定了野生雪峰虫草的挥发性成分，分别从石油醚部位鉴定了 44 个化合物，乙酸乙酯部位鉴定了 28 个化合物，主要为酸类、酯类和甾醇类等成分。朱如彩等[56]以腺苷为考察指标，对雪峰虫草的采收时期和质量进行评价，发现以 8～12 月份采收的雪峰虫草腺苷含量最高，为最佳采收时期。秦优等[57]建立 11 批雪峰虫草的高效液相色谱指纹图谱，通过主成分分析筛选出核苷类成分作为评价雪峰虫草药材质量的指标成分。这些研究为雪峰虫草有效物质基础和相关疾病的临床治疗研究提供参考和借鉴。

近年来随着虫草发酵液和子座人工培育的成功，其活性物质也备受学者关注。刘莎等检测雪峰虫草菌丝体发酵液，成功检测到了胞内、胞外多糖，胞内虫草酸，胞内总三萜等成分[52,58]，且胞内多糖的抗氧化活性优于胞外多糖[58]，Zou等和Jin等也在人工培育的虫草中检测到了核苷类成分[23,59]，且基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技术在雪峰虫草中识别检测到了虫草素[54,57,60]。笔者前期对野生雪峰虫草、人工子座、人工虫菌复合体和发酵菌丝体的核苷类成分进行了定性、定量研究，基于HPLC-Q-TOF-MS/MS识别到了 8 种核苷类物质，且不同形式的雪峰虫草核苷类物质差异不大[23]，但与蛹虫草中的虫草素对比，雪峰虫草的虫草素含量极低。可见雪峰虫草中的主要活性成分不是虫草素，可能是虫草多糖，雪峰虫草的具体活性成分有待进一步明确。

5 药理作用研究

虫草的药理作用广泛，具有抗肿瘤[61]、抗菌[62]、抗辐射、抗炎[63-65]，抗衰老[66]、调节免疫力[67]、抗氧化、抗细胞凋亡[68]、治疗糖尿病[69]、止痛、抗过敏等生理作用[53]，冬虫夏草补肾益肺、止血化痰，主要用于肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘、劳嗽咯血的治疗。而洞口县当地大多数老百姓将雪峰虫草煎煮、炖服、泡酒服用以提高免疫力，防治肝癌、肺癌等，普遍反映效果显著，洞口县老年科技工作者协会也以雪峰虫草为原料申请了“治疗肝癌的中药及制备方法”专利(专利号201410205332.3)。

前期研究发现雪峰虫草在补肾壮阳、抗疲劳和抑制肿瘤细胞方面的功效。谢芳一等[70]用野生雪峰虫草打粉后制成水混悬液，分别用低、中、高剂量灌胃肾阳虚模型大、小鼠，结果发现雪峰虫草 3 个剂量组均能显著缩短大鼠阴茎勃起时间(勃起潜伏期)、增加大鼠精囊腺+前列腺指数，具有壮阳作用；能增加小鼠 10 min 内自主活动次数、负重游泳时间，具有改善肾虚模型小鼠症状的作用。中、高剂量组能显著增加小鼠实验后体质量，具有改善肾虚模型小鼠症状的作用。郑兵等[71]用野生雪峰虫草粉末的水煎液与DC-CIK细胞及肝癌Hep G-2共培养，结果发现 0.1 mg/mL 雪峰虫草水提物对DC-CIK有显著的促增长作用，但雪峰虫草没有直接杀伤肿瘤细胞的作用，需通过促进DC-CIK的增殖，增加DC-CIK 的数量而起到增强其对肝癌Hep G-2细胞的作用，Jin等[60]通过对比试验发现野生雪峰虫草、人工培育的子座和菌丝在体外均有抑制癌细胞的作用。雪峰虫草药理作用的研究为其临床应用提供了实验依据，而其作用机制及能否用于相关疾病的临床治疗还有待于今后的进一步深入研究。

6 展 望

雪峰虫草与冬虫夏草亲缘关系近，其基础研究的深入，特别是人工培育为冬虫夏草的人工培育提供了经验和参考，然而雪峰虫草的研究仍然存在一些问题。首先，巨疖蝙蛾幼虫人工培育取得了进展，但距规模化生产还有一定的差距，雪峰虫草全人工培育受限，并带来一系列问题：①为了避免幼虫在野外感染雪峰虫草菌或者其他杂菌，幼虫需要在无菌环境饲养 1～2 个月，以排除雪峰虫草和杂菌感染；②巨疖蝙蛾的采挖费时费力，采挖成本高达 10～15 元/条；③采挖期间需要砍大量的大青树，破坏生态环境。而一直以来，虫草的研究都集中在菌上，对虫的研究很少，加强对寄主幼虫的研究，将推动虫草全人工培育的研究。其次，雪峰虫草子座容易培养，但是其子实体培养暂未成功，在一定程度上限制了虫草菌的复壮和菌种选育。雪峰虫草子座人工培育 2～3 个月后，在强光条件下，子座顶端表面容易形成螺纹结构，有助于分生孢子的产生，但未能获得长有子囊壳的子实体。子实体产生可能需要适当延长雪峰虫草的培养时间，探索适宜的环境条件，也有可能因为单一交配型的菌种难以获得子实体[47,72]。雪峰虫草子实体的诱发及生长条件需要进一步探索，其形成的分子机制有待深入研究。再次，雪峰虫草是近年来发现的新种，与冬虫夏草同为Ophiocordycipitaceae 科Ophiocordyceps属真菌。通过基因序列比对和分子发育系统学分析，雪峰虫草与冬虫夏草亲缘关系非常接近[11]，雪峰虫草生长环境温和，对气候要求不严格，其寄主巨疖蝙蛾幼虫虫体较大，分布区域广泛，适应生态幅大，均易实现人工培育，且研究发现雪峰虫草有与其他虫草相似的活性物质和药理作用。雪峰虫草是值得研究的新型虫草种质资源，加强雪峰虫草人工培育，能填补我国虫草需求的巨大缺口。其人工培育已取得突破性进展，但其药理毒理研究相对滞后。因此，完善物质基础和药理作用方面的基础研究，为虫草的临床应用等提供参考和依据。