链霉菌次级代谢产物高产菌株的构建策略

陈奕公，徐春燕，岳思君，李雅楠，苏建宇

(宁夏大学生命科学学院 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021)

来源于链霉菌的次级代谢产物在医学、畜牧兽医、植物保护等领域具有重要的应用价值[1]。由于部分链霉菌次生代谢产物难以实现高通量筛选，且绝大多数新发现的次级代谢产物基因簇在常规发酵中不表达或者表达量极小，因此，需要对野生链霉菌菌株进行改造，使其高效表达这些次级代谢产物基因簇，从而支撑相应次级代谢产物的产品开发和产业化生产[2-3]。传统的物理化学诱变通过单一或复合的诱变筛选，得到次级代谢产物高产突变菌株，但长期重复使用某种诱变方式会导致菌株抗性饱和、突变率降低以及突变谱变窄。随着全基因组测序技术的普及，通过对比分析野生菌株和正向突变菌株的基因组序列，结合转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及酶学研究，使得在基因组水平上研究自发突变和诱导突变的过程以及基因突变与产量性状之间的关系成为可能，从而有助于通过代谢工程手段进一步提高菌株次级代谢产物产量。本文综述了近年来链霉菌次级代谢产物高产菌株构建的相关研究进展。

1 基因表达调控提高产量

细胞代谢调控网络决定着链霉菌次级代谢产物基因的表达。对于次级代谢产物基因表达的调控，目前常采用启动子优化选择、正调控基因过表达、负调控基因阻断抑制、转录及翻译元件修饰、转运蛋白翻译后磷酸泛酰巯基乙胺羟基化等策略，提高细胞次级代谢产物的表达量。

1.1 启动子优化选择

强启动子可有效提高目的基因的表达量，因此被广泛应用于次级代谢产物高产菌株的构建。ermEp*是链霉菌中使用最为普遍的组成型强启动子，此外，诱导型强启动子tcp830[4]、PA3[5]、tipAp、nitAp[6]、actIp、TREp[7]等也广泛应用于链霉菌代谢工程和合成生物学改造。针对不同的链霉菌宿主采用不同启动子，目的基因的表达效果可能会存在差异，因此需要在工程菌株构建时对启动子进行优化选择。李佳等[8]将加纳链霉菌(S.ghanaensis)phage I19中的多重强启动子Psf与ermEp*通过卡那霉素抗性梯度及邻苯二酚2，3-双加氧酶显色系统进行比较，发现在大部分链霉菌中Psf与ermEp*均可使目的基因高效表达，但棒状链霉菌(S.clavuligerus)以及S.coelicolor中Psf的表达活性要高于ermEp*。杨克迁课题组将Kasop*与链霉菌中已有的强启动子ermEp*和SF14p在S.coelicolor中进行对比，发现Kasop*具有最高的转录及蛋白水平活性[9]。该课题组对S.coelicolor中不同时序转录组数据进行分析和实验验证，获得了116个不同强度的组成型启动子，为链霉菌合成生物学研究提供了有力的元件支持[10]。

1.2 基因的正、负调控表达

过表达正调控基因可在很多次级代谢产物的合成中发挥促进作用。弗氏链霉菌(S.fradiae)泰乐菌素的生物合成受多个正、负调控因子调控[11-12]。将正调控基因tylR插入弗氏链霉菌基因组φC31attB位点，使其在胞内形成双拷贝，在组成型强启动子ermEp*转录控制下，可使Lilly公司S.fradiaeC4菌株的泰乐菌素产量提高50%[13]。同样是16元大环内酯类抗生素，螺旋霉素的生物合成中的关键基因SrmR(Srm22)受到Srm40的正调控[14-15]，在ermEp*转录调控下导入含srm40的多拷贝质粒，可以使螺旋霉素的效价提升近4倍。

敲除或抑制负调控基因，也是显著提高链霉菌次级代谢产物产量的途径之一。野生型链霉菌S.rapamycinicus的雷帕霉素产量低于10 mg/L。雷帕霉素合成受5个调控基因的影响[16]，其中负调控基因rapY、rapR、rapS分别编码TetR家族阻遏蛋白双组分应答调控因子、应答因子以及组氨酸激酶，过表达任何一个负调控基因都会导致雷帕霉素产量的下降，而敲除rapS或rapY都会使雷帕霉素效价提高。Yoo等[17]通过敲除rapS基因，并在ermEp*转录控制下双拷贝过表达能抑制rapY表达的rapX，最终S.rapamycinicus的雷帕霉素的产量达到49 mg/L，较出发菌株提高6.7倍。而单独组成型表达rapX能使雷帕霉素产量提高3.5倍。Wu等[18]发现TetR家族负调控基因SACE_3986对红色糖多孢菌(S.erythraea)红霉素生物合成具有负调控作用，敲除SACE_3986后，S.erythraea的红霉素产量可增加54%。阻断负调控基因同样可以提高核苷类抗生素的产量，在Muraymycin生产菌珠Streptomycessp.NRRL30471中，阻断其基因簇中的负调控基因mur34，可以将Muraymycin C1和D1产量提高10倍[19]。

1.3 转录与翻译元件的修饰

研究表明，链霉菌利福平抗性突变株中编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因发生点突变，其结果使变铅青链霉菌(S.lividans)的十二烷基灵菌红素、放线紫红素和钙依赖性抗生素产量均有所提高[12]，同样的现象也存在于S.erythraea合成红霉素、灰色链霉菌(S.griseus)合成链霉素、抗菌素链霉菌(S.antibioticus)合成放射霉素、白色链霉菌(S.albus)合成盐霉素[20]。除rpoB外，RNA聚合酶主要的σ亚基(HrdB或σHrdB)已被确定为提高阿维链霉菌(S.avermitilis)阿维菌素产量的有效作用靶点[21-22]。

研究发现，阻断编码30S核糖体亚基装配辅助因子的rimP基因，可提升S.coelicolor的放线紫红素以及钙依赖性抗生素的产量[23]，也会提高异源表达的华光霉素和多氧霉素合成基因的水平。rimP突变体生长较亲代缓慢，但有着更高的转录和翻译保真度，会提升5种全局调控基因absR1、adpA、afsR、atrA和rnc的转录，减少3种负调控因子phoP、ndgR和ssgA的转录，提升metK(编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶)以及放线紫红素和钙依赖性抗生素合成代谢通路上的特异性激活因子ActII-ORF4和CdaR的翻译水平。而过表达编码核糖体循环因子的frr基因，可使S.coelicolor的放线紫红素产量及S.avermitilis的阿维菌素产量得到提高[12]。

链霉菌在稳定期合成蛋白的能力是启动次级代谢产物合成的关键。S.coelicolor合成放线紫红素过程中，特异性转录调控蛋白ActII-ORF4的浓度决定着同源合成结构基因的转录效率[24]。Wang等[25]通过向S.coelicolor中引入多重抗生素抗性基因(str、gen、rif、par、gnt、fus、tsp、lin)，筛选到能同时耐受7～8种抗生素的突变菌株C7、C8，其突变核糖体有异常的蛋白和ppGpp合成活性，结果使放线紫红素的产量较野生型提高180倍。大量同类研究表明对核糖体进行修饰改造是提升次级代谢产物产量的有效途径之一。

1.4 载体蛋白翻译后的修饰

I型和II型聚酮合酶(PKS)与非核糖体肽合成酶(NRPS)中，酰基载体蛋白(ACP)、肽酰载体蛋白(PCP)及巯基化区域需经磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTases)修饰连接磷酸泛酰巯基乙胺基团使其发挥生物活性[26]。在链霉菌中，有AcpS型和Sfp型两种PPTases[27]，是控制合成聚酮的限速酶。

Fernández-Martínez等[28]确定了S.venezuelae中一个编码与氯霉素生物合成有关的Sfp型PPTase基因cmlL，通过在S.coelicolorM1152中表达cmlL，使得氯霉素产量达到50 mg/L，当敲除该PPTase基因后，氯霉素产量只有20 mg/L。Hui等[29]发现在聚烯大环内酯类抗生素游霉素生产菌株S.chattanoogensisL10中，有两种PPTases(Sfp型SchPPT和AcpS型SchACPS)，其中SchPPT可以激活I型及II型聚酮合酶的酰基载体蛋白，SchACPS可以激活II型聚酮合酶和脂肪酸合成酶的酰基载体蛋白。阻断SchPPT基因会导致游霉素合成受阻，而过表达SchPPT的重组子，游霉素产量较亲本菌株可提高40%。

2 转座子突变提高产量

转座子可在链霉菌中用来阻断、比对次级代谢产物生物合成基因，通过插入基因片段来提高次级代谢产物产量。转座子还可用来鉴定链霉菌染色体中的中性插入位点[30-31]。

链霉菌中导入自我复制的质粒后会明显影响次级代谢产物的产量。将编码泰乐菌素生物合成关键酶——大菌素甲基转移酶的tylF基因插入自我拷贝质粒pIJ702中，导入泰乐菌素生产菌S.fradiae内，会导致泰乐菌素前体物质合成量及泰乐菌素产量显著降低。通过pKC796质粒将tylF插入φC31attB位点并整合至染色体，导致S.fradiae所有大环内酯产量降低[32]。解决这一问题的有效办法就是把基因插入到染色体的中性位点内。可以采取的策略：①将目的基因插入转座子中并导入染色体内，再筛选中性位点插入基因的重组子；②首先通过转座子突变鉴定宿主菌染色体中性位点，再通过同源重组向转座子序列插入目的基因；③克隆染色体中性位点，插入目的基因，再通过同源重组整合进中性位点。Solenberg等[33]对Lilly公司泰乐菌素生产菌株S.fradiaeC373.17进行中性位点分析，结果表明其染色体中有约50%的插入位点为中性，其他位点则会导致泰乐菌素发酵效价降低，揭示了S.fradiae编码的大约3 000个基因并不是高产泰乐菌素所必须的。通过转座子Tn5099互换，该课题组将tylF的第二个拷贝插入S.fradiaeC373.17染色体的中性位点上，可将泰乐菌素的发酵产量提高30%。

3 合成生物学方法提高产量

借助基因组挖掘技术，已有越来越多的次级代谢产物合成基因簇被人们所了解。通过对次级代谢产物合成基因(簇)的复制及扩增、删除或阻断次级代谢产物的竞争通路、重构未知次级代谢产物基因簇及其异源表达、次级代谢产物高效表达体系构建等合成生物学手段在提高次级代谢产物产量方面发挥着越来越重要的作用。

3.1 次级代谢产物合成基因的复制及扩增

独立基因或完整的次级代谢产物基因簇的复制及高度扩增是提高次级代谢产物效价的有效方法[12]。针对次级代谢产物合成前体的供给等问题，在插入解除限速的基因后，原次级代谢产物产生菌也可充当宿主，借助诱变、重组和其他靶向分子遗传途径来进一步提高次级代谢产物的产量。

细菌人工染色体(BAC)和由P1噬菌体衍生的人工染色体(PAC)载体中，可以克隆很大的链霉菌DNA片段[34]，因而可以插入次级代谢产物基因簇或外源功能基因片段，实现增加目的基因拷贝数或增加次级代谢产物产量的目的[35]。Yanai等[36]以卡那霉素生产株系为出发菌株，通过增加卡那霉素基因簇拷贝数，筛选到卡那霉素高产菌株卡那霉素链霉菌(S.kanamyceticus)12-6，其卡那霉素产量可达到376 mg/L，是亲本产量水平的2倍。Murakami等[37]构建了ZouA介导的DNA扩增系统[38]，使S.coelicolor放线紫红素产量达到450 mg/L，高于对照水平20倍。Zhou等[39]在吸水链霉菌(S.hygroscopicus)5008中应用了这个系统扩增井冈霉素A的基因簇，将井冈霉素的基因簇进行多拷贝串联，使井冈霉素A产量由15 g/L提高至21 g/L(图1)。

图1 ZouA介导的DNA扩增系统在不同宿主内的应用Fig.1 Application of ZouA mediated DNA amplification system in different hostsKan：卡那霉素；Act：放线紫红素；Val：井冈霉素Kan：Kanamycin；Act：Actinomycin；Val：Jinggangmycin

3.2 删除或阻断次级代谢产物的竞争通路

链霉菌合成的具有生物活性的次级代谢产物在胞内过量积累会影响其自身生长或对其合成途径产生反馈抑制，从而限制产物产量的提高。此外，次级代谢产物发酵中，副产物的积累也会影响目的产物的合成及产品纯度，限制了目的产物的发酵水平与实际应用。删除或阻断次级代谢产物的竞争通路可有效解决这一问题。

在尼莫克汀发酵生产中，LL-F28249λ(该组分难以去除)、LL-F28249γ和LL-F28249ω三种副产物的生成影响了尼莫克汀的产量和产品纯化。研究发现，尼莫克汀生物合成基因簇中，nemD失活可导致C5-OH基团不能被进一步甲基化，从而阻断LL-F28249λ和LL-F28249γ的合成。党福军等[40]通过构建和筛选蓝灰链霉菌(S.cyaneogriseus)基因组文库，获得与LL-F28249ω合成相关基因nolB，采用连续敲除的方法定向改造尼莫克汀生产菌株，获得敲除nemD和nolB的分子改造菌株，不仅使尼莫克汀发酵水平提高27.4%，且发酵产物中不再含有上述三种杂质成分。肖剑萍等[41]通过敲除黑暗链霉菌(S.tenebrarius)Tt-49中磷酸变位酶基因aprJ，阻断了安普霉素合成，使菌体代谢流转向合成氨甲酰妥布霉素。在此基础上，再进一步敲除氨甲酰基转移酶基因tobZ，使妥布霉素无法正常氨甲酰化，从而构建了大量积累妥布霉素、不再合成安普霉素和氨甲酰妥布霉素的工程菌株。

3.3 重构未知次级代谢产物基因簇及其异源表达

基因组测序和分析技术的进步，使得链霉菌中大量与次级代谢产物合成相关的隐性基因簇被逐渐发现。为了激活细胞内隐性基因簇，常用的方法是将某个基因簇完整地转入另一宿主进行表达，或者采用各种极端条件刺激菌体以启动其隐性基因簇的表达。这些方法操作繁琐，且大量试验后未必能获得理想的效果。

Luo等[42]采用DNA assembler技术，将启动子插入一个隐性基因簇中单个基因之间，来协助调控邻近基因表达的数量和时机，使基因簇中的每个基因均能被持续激活，进而改编细胞内的基因表达调控。他们将6个启动子插入S.griseus中的隐性基因簇(包含6个基因)中并导入异源宿主S.lividans内进行表达，重构的菌株合成了一些大环内酰胺代谢产物(PTM)，很多具有生物医学应用的潜力。在进一步的研究工作中，该课题组[43]通过对S.albusJ1074进行RNA序列分析，从筛选得到的32个强启动子中选取5个强度最高的启动子，引入S.griseus基因组扩增出的PTM基因簇开放阅读框内进行重构，并分别在S.lividans66、S.albusJ1074和S.coelicolorM1146中成功表达，PTM的效价相较于对照得到了明显提升。

3.4 高效表达底盘的构建

链霉菌属的微生物是很多天然活性产物的合成载体，可充当宿主并借助同源的合成通路来表达相应的次级代谢产物基因簇。应用于基因组挖掘技术及次级代谢产物生物合成的链霉菌表达宿主需要在不影响自身生长和目标产物合成的前提下，去除一些非必须次级代谢产物基因簇，将基因组简化或删除部分竞争途径[44]。利用同源重组方法敲除基因需要消耗大量时间，Zhou等[45]耗时多年通过连续敲除，构建了一个去除900 kb端粒序列(占全基因组的14%)以及全部10个PKS、NRPS基因簇的S.coelicolor菌株，并在此基础上实现了放线紫红素的过表达。

φBT1整合酶能在体外高效催化attB和attP之间的重组反应，快速构建基因打靶载体，完成靶标基因的替换。Zhang等[46]运用此方法在阻断S.coelicolorM145中钙依赖性抗生素以及放线紫红素合成通路的基础上，敲除十二烷基灵菌红素合成负调控基因rrdA，从而得到比野生型十二烷基灵菌红素产量高5倍以上的突变株ZB8。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现，为多个不同基因组的编辑以及改造表达体系提供了新的途径。CRISPR/Cas9技术可在链霉菌中高效删除基因或基因簇，实现基因的精确替换，并能可逆地控制靶基因的表达[47]。

Cobb等[48]将CRISPR/Cas9系统应用于链霉菌多基因快速编辑，在S.lividans、S.albus、绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)中能够删除单个或两个次级代谢产物合成基因簇片段(20～30 kb)，删除效率高达70%～100%。他们运用pCRISPomyces系统在S.lividans中高效删除了十二烷基灵菌红素完整合成途径的基因簇(31.4 kb)，在S.albusJ1074中删除了聚酮合酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)杂合基因簇(13.2 kb)，从而切断了该代谢通路。

Huang等[49]建立了用于链霉菌基因操控的高效CRISPR/Cas9基因组编辑质粒pKCcas9dO，包括一个靶向特异性向导RNA、密码子优化的cas9以及两个同源介导的双链DNA修复(HDR)模板(图2)。通过一步接合转移，将pKCcas9dO系列编辑质粒导入模式菌S.coelicolorM145中，获得不同编辑水平的基因组，包括actll-orf4、redD和glnR单基因的缺失，放线紫红素(21.3 kb)、十二烷基灵菌红素(31.6 kb)以及钙依赖性抗生素(82.8 kb)独立次级代谢产物基因簇的缺失，编辑效率可达60%～100%。

图2 CRISPR/Cas9基因编辑质粒pKCcas9dO的编辑策略Fig.2 Editing strategy of CRISPR/Cas9 gene editing plasmid pKCcas9dO

4 组学方法的综合应用

Robles-Relglero等[50]通过对S.clavuligerus全霉素高产突变株进行蛋白组学分析，发现突变株中HlmD、HlmF以及HlmG相对野生菌株呈现表达差异，通过蛋白质质谱测定其末端蛋白序列以及在高产株中对hlmH、hlmE、hlmM、hlmI进行失活试验，定位了S.clavuligerus全霉素生物合成基因簇，并在S.albus中异源表达了全霉素，说明基因簇中与全霉素合成相关的结构基因是完整的[51]。Lum等[52]比较分析了红霉素生产菌S.erythraea的野生型和高产菌株，发现红霉素合成基因簇中没有相关的调控基因，转录组数据表明红霉素合成基因持续协同表达可能是受一个全局调控机制的影响。为了找出可能的全局调控蛋白，Chng等[53]进行DNA结合实验发现BldD蛋白关联着红霉素合成基因簇内的所有5个启动子区域。相较于野生型，红霉素生产菌株中bldD表达水平更高，当敲除bldD后，会影响红霉素生产菌在固体培养基中的生长分化，并导致红霉素产量降低7倍。Kirm等[54]通过比较蛋白质组学对S.erythraea的野生型和生产菌株进行分析，寻找生产菌中的高表达调控基因。他们发现编码调控蛋白SACE_5599的基因与林可链霉菌(S.lincolnensis)中林可霉素合成途径中的lmbU基因以及类球形链霉菌(S.spheroides)中新生霉素基因簇内的novE正调控基因相关。转录研究表明红霉素生产菌株中SACE_5599表达量是野生型的20倍。在野生型菌株中双拷贝组成型表达SACE_5599可提升红霉素产量，在生产菌株中则没有提升，但在生产菌株中敲除SACE_5599会导致产孢缺陷，红霉素效价下降。SACE_5599以及bldD的过表达，可提升菌体红霉素的合成和产孢能力，同时也表明这两个基因是紧密关联的。

5 展 望

链霉菌基因组内含有大量的次级代谢产物生物合成基因簇，能编码丰富的次级代谢产物，是抗生素等生物活性物质筛选的重要来源。然而，许多链霉菌次级代谢产物合成基因簇处于沉默状态，实验条件下并不表达合成相应产物，或表达量很低，传统的筛选方法很难获得新的有价值的次级代谢产物。随着全基因组测序和分析技术的不断发展，越来越多的链霉菌隐性次级代谢产物合成基因簇被发现，这些隐性基因簇所编码的产物大多数是未被鉴定的化合物。深入研究这些新发现的链霉菌次级代谢产物，对于推动新型治疗药物的开发具有重要意义。因此，必须建立使链霉菌大量表达这些产物的技术方法。

利用基因工程技术，对链霉菌隐性次级代谢产物合成基因簇的表达及产物合成代谢调控等方面进行系统研究，在此基础上，采取合理的构建策略对链霉菌菌株进行分子改造，激活其中的隐性基因簇或对隐性基因簇进行异源表达，使次级代谢产物的合成量显著提高，将为新型治疗药物的发现和研究奠定重要的基础。这方面的研究将是今后链霉菌生物活性物质研究领域的重要工作。