不同培养条件下金黄色葡萄球菌表型可塑性研究

朱 璟,王峥鉴，张佐然,李金婷,梁雅静,金 一,何晓青

(北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083)

进化理论一般认为，相同的基因型在不同环境条件下表现出不同表型的现象称为表型可塑性[1]。生物有机体能够通过表型可塑性这一机制，产生选择性的表型变化或反应，以应对环境的改变。生物体的这种表型反应往往具有明显的选择优势，能够在物理性状或生理反应上产生一定的变化，以促进生物体的发展。表型可塑性在生物界普遍存在，在植物与动物领域均有报道[2-3]，但在微生物领域尤其是细菌表型可塑性方面的研究相对较少[4-5]，利用分子标记技术来研究微生物表型可塑性的方法鲜有报道。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界，是人类的一种重要的病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰阳性菌的代表[6]。通常金黄色葡萄球菌对营养物质的要求不高，在普通培养基上生长情况良好，但研究表明其与大肠埃希菌混合培养时，表现出明显的竞争劣势。本研究在金黄色葡萄球菌生长环境中引入大肠埃希菌与其混合培养，并与单独培养的金黄色葡萄球菌对比，欲探究两种培养条件下金黄色葡萄球菌的表型变化规律。全基因组关联分析法(Genome-wide association study，GWAS)是Risch等[7]在1996年提出的在全基因水平上对复杂的表型形状进行关联分析的方法，它以连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)为基础[8-9]，通常以上万个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)作为标记，筛选出其中与表型相关联的标记，并分析其遗传效应[10]。双变量GWAS分析是GWAS分析的一种，其能够同时考虑两种表型，在统计效力和参数估计精确性方面优于单变量分析[11]。相比于单变量GWAS，通过对双变量GWAS合并培养时间及培养环境的关联信息进行分析，可以获得更高的统计效率。因此，双变量GWAS能够检测出单变量GWAS无法发现的少数显著SNP位点。在效率方面，双变量GWAS的计算量仅为单变量GWAS的一半，从而减少了SNP的检测周期，提高了检测效率。双变量GWAS法能够快速有效地识别调节表型变异的遗传因素，便于鉴定出致使某种表型变化的遗传基础[12]，且适用于细菌等微生物[13]。金黄色葡萄球菌是全基因组研究合适的模式生物，以金黄色葡萄球菌表型可塑性为研究对象的GWAS分析在微生物领域具有代表性。本研究以45株金黄色葡萄球菌为研究对象，设置两种不同的培养环境，观察并记录了连续培养过程中金黄色葡萄球菌生长量的变化，采用双变量GWAS法，结合金黄色葡萄球菌在两种不同培养环境下的生长差异及基因组测序结果，得到显著SNP位点。同时找到与金黄色葡萄球菌生长变化显著相关的SNP，分析显著SNP与金黄色葡萄球菌生长的关系及对应基因mRNA相对表达量，进一步分析其表型可塑性的表现形式及规律，为表型可塑性在微观水平的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 根据本实验室现有条件，选择45株金黄色葡萄球菌及1株大肠埃希菌作为实验的研究对象。40株金黄色葡萄球菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)、中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)、中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、中国农业菌种保藏中心(ACCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、中国药学微生物菌种保藏管理中心(CPCC))，另外5株由中国农业大学动物医学院赠与。1株大肠埃希菌购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。所有菌株保存于-80 ℃。

1.1.2 培养基及试剂 脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion,BHI)培养基(OXIOD，英国)；胰蛋白酶大豆琼脂培养基(OXIOD，英国)；细菌基因组提取试剂盒(天根，中国)；细菌总RNA提取试剂盒(天根，中国)；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)(天根，中国)；SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(天根，中国)；溶菌酶(Amresco，美国)；溶葡萄球菌酶(Sigma，美国)。

1.1.3 仪器与设备 超净工作台(ESCO Class II，新加坡)；电子天平(METTER，瑞士)；H2O3程控金属浴(Gingko Bio，中国)；离心机(Beckman Coulter，美国)；HYG-A全温摇瓶柜(培英，中国)；冰箱(SANYO，日本)；高压灭菌锅(SANYO，日本)；移液枪(Eppendorf，德国)；瓶口分液器(SOCOREX，瑞士)；Thermo Scientific NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美国)；Mx3000P 荧光定量PCR 仪(Stratagene，美国)；流式细胞仪(BD FACS Calibur，美国)等。

1.2 方法

1.2.1 细菌的活化和连续培养 设定金黄色葡萄球菌单独培养及金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌混合培养两种培养模式，分别用45株金黄色葡萄球菌与1株大肠埃希菌进行配对。45株金黄色葡萄球菌编号为J1～J45，1株大肠埃希菌编号为D1。将所有菌株从-80 ℃冰箱中取出并将各菌株接种于稀释2倍的BHI培养基并置于30 ℃、130 r/min摇床中过夜培养，以活化菌株。利用流式细胞仪确定从各瓶中取出的菌液量，转接到新的稀释2倍的BHI培养基中，将起始浓度定为5×103cells/mL，置于30 ℃、130 r/min摇床中培养。24 h后每个菌种培养液取出两管1 mL菌液冻存(一管作为重复)，用于后续基因组的提取和qPCR实验，并将其定位为第一个细菌拷贝数测量点。同时，迅速从培养液中转接1 mL菌液至新的稀释2倍的BHI培养基中，以保证两种细菌享有足够的营养物。24 h后继续按照上述步骤转接，转接至第12天时两种细菌的拷贝数基本保持稳定，故转接至第12个测量点时结束培养。

1.2.2 细菌全基因组提取 将12次转接保存的菌液各取出1 mL，使用细菌基因组提取试剂盒并在破壁步骤中结合使用溶菌酶和溶葡萄球菌素，分别提取1 mL菌液中的基因组，最后将提取得到的基因组溶解在200 μL洗脱缓冲液TE中。

1.2.3 qPCR测定细菌的生长量(绝对定量) 荧光定量PCR能准确定量出样本DNA的拷贝数，本研究使用SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(TIANGEN，北京)在Mx3005P 荧光定量PCR仪内完成荧光定量PCR。绝对定量所需的标品由质粒pBM19S-nuc耐热核酸酶基因(nuc)与pBM19-B Simple 载体构建而成，质粒均由实验室提供。根据靶基因的选择原则，以耐热核酸酶基因nuc)为目的基因，设计目的片段为226 bp的引物，引物的序列如下：nuc-F(AGATAACGGCGTAAATAGA)，nuc-R(ACTTGCTTCAGGACCATA)。从提取的基因组溶液中取出2 μL构建反应体系，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40 个循环，退火延伸时检测、收集荧光信号。每个样品的拷贝数由软件Stratagene MxPro计算得出，再换算成1 mL基因组样品中的拷贝数，作为金黄色葡萄球菌在该生长点的生长量数据。

1.2.4 双变量全基因组关联分析 将提取所得的基因组样品进行全基因组测序，测序结果与实时荧光定量PCR得到的生长量数据结合比对，使用GWAS法对45株金黄色葡萄球菌和1株大肠埃希菌混合培养的12个取样点的基因组与表型多态性之间进行了双变量连锁分析，筛选了与生长量变化显著相关的全基因组SNP位点，并绘制曼哈顿图(Manhattanplots)。

1.2.5 检测scdA基因的相对表达量 取出1 mL连续培养保存的菌液，用细菌总RNA提取试剂盒提取RNA，立即使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)进行反转录。根据T检验筛选结果，选择其中最具代表性的SNP进行功能验证。在GenBank上查找该SNP所位于的基因，并以该基因序列为模板设计引物，使用SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(TIANGEN，中国)进行qPCR，其中目的片段的引物序列：F1(CAGACCACATTGCAACGGGAGAA)、R1(CGTGATTCTCTAAATGTACGTGTTC)，内参为16S rRNA，其扩增的引物序列：16S-F(TGTCGTGAGATGTTGGG)、16S-R(CGATTCCAGCTCATGT)。荧光定量PCR得到的CT值用2^-△△T相对定量法换算，得到该基因的相对表达量，作为对应的表型数据。

1.2.6 相对表达量差异性检测 检验法能够检测两组独立样本的差异性，利用T检验法分析金黄色葡萄球菌在单独培养和混合培养下scdA的表达量差异及SNP251050两种核苷酸下scdA的表达量差异。P<0.05 为显著，P<0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 两种培养方式的生长量结果

图1展示了所有取样点金黄色葡萄球菌1号菌株单独培养(mono-S)及与大肠埃希菌混合培养(co-S)的拷贝数结果，混合培养中的大肠埃希菌(co-E)作为参考。结果显示在营养物质充足的条件下，单独培养的金黄色葡萄球菌拷贝数明显高于混合培养中的拷贝数，达2～4个数量级，说明金黄色葡萄球菌在混合培养中的生长受到了大肠埃希菌的抑制。本研究中的45株金黄色葡萄球菌均表现出以上生长规律。

图1 qPCR法测量金黄色葡萄球菌单独培养及混合培养生长量结果Fig.1 Growth data of S. aureus in mono-culture and co-culture by qPCR

2.2 GWAS检测显著SNP位点结果

双变量GWAS法一共检测出了415个显著单核苷酸多态性位点，随着培养的进行，各取样点的最大-log10(P)值整体呈现上升趋势。其中取样点1未检测出显著SNP位点，取样点10检出最多，达61个。取样点4、6、7、8、9、10、11、12的显著SNP数量均超过了30个，P值最大的SNP(-log10(P)= 11)出现在取样点12。对检出的SNP，选择重复性高的进行基因功能注释。根据注释结果，选取导致非同义突变并表达已报道对应蛋白功能的SNP展开研究，分别是251050、797150、1043869、212837、73965、870315、73916、785111。这些SNP的最大P值点分别在图2曼哈顿图中标出(红线以上表示显著，纵坐标表示每个取样点SNP的-log10(P)值)，具体数值参见表1。

表1 8个SNP位点对应基因和蛋白质功能表Table 1 Summary of candidate genes and proteins of the 8 selected SNPs

注：SNP对应基因的ID从GWAS的分析结果中查询获得，基因的名称从NCBI官网上查询获得

2.3 非同义突变显著SNP的基因类型与蛋白功能汇总

8个金黄色葡萄球菌显著SNP均导致非同义突变，对应基因所表达的蛋白均有文献报道(表1)。其中SNP251050在第8个取样点中的-log10(P)值达较高水平的7.43，其在单独培养(P=6.16×10-3)和混合培养(P=1.49×10-5)两种培养环境下的T检验差异检测结果都极显著。并且SNP251050对应基因表达的scdA蛋白是一种肽聚糖交联的细胞壁生物合成蛋白质，参与细胞壁合成、周转等生命活动，与金黄色葡萄球菌的生长量关系紧密。故将SNP251050所位于的基因scdA作为验证金黄色葡萄球菌表型可塑性的扩增对象，并测定mRNA相对表达量。

图2 GWAS检测显著SNP位点曼哈顿图Fig.2 Manhattan plots of the significant SNPs by the genome-wide association analysis

2.4 两种培养模式下scdA基因相对表达量的对比

SNP位点具有二态性，故将45株菌按照SNP251050的A型或G型结果进行分类比较，两种类型下单独培养和混合培养第8个转接点的相对表达量结果如图3所示：黑色“+”为对应培养模式下的相对表达量平均值。T检验结果表明，SNP251050表现为G型时，对应基因在混合培养环境中相对表达量显著高于在单独培养环境中的相对表达量(P=3.15×10-11)，同样表现为A型时，对应基因在混合培养环境中相对表达量显著高于在单独培养环境中的相对表达量(P=4.55×10-8)。

图3 两种培养模式下scdA基因相对表达量结果Fig.3 Relative expression of gene scdA in two culture modes

3 讨 论

传统的进化学说中，生物体适应环境的基本单位是基因型，而表型可塑性的研究带来了不同的观点：表型可塑性是指某一特定的基因型处于不同的环境条件时能够表现出不同的表现型，生物体利用其可塑性来响应并适应环境的变化。生物体的表型可塑性不单指形态学上的可塑性，更多表现为生理行为、活动的可塑性，其反映了生物与环境之间的关系。

本研究以45株金黄色葡萄球菌为研究对象，设置两种不同的培养环境，利用与大肠埃希菌混合培养的方式给予金黄色葡萄球菌一定的竞争压力，用qPCR法测定不同培养时间点的金黄色葡萄球菌在两种生长环境下的生长量拷贝数。又结合双变量GWAS的方法，得到了415个与生长量表型显著相关的SNP位点。这些显著SNP中，大部分表达的是假定蛋白，假定蛋白是一类无实际蛋白信息的开放阅读框[20]，因此在本研究中不予深究。此外，编码区的SNP存在同义和非同义两种多态类型，SNP的同义突变并不影响蛋白质序列，而SNP的非同义突变则会改变蛋白质的氨基酸序列[21]。本研究在剔除相关基因表达假定蛋白的SNP以及同义单核苷酸多态性SNP后，得到了8个与生长量改变显著相关的SNP，测定其中最具代表性的SNP251050相关基因mRNA表达量变化，研究了金黄色葡萄球菌生理水平的表型可塑性，展现了细菌在环境改变过程中产生的表型可塑性效应[22]。

SNP251050对应的基因表达细胞壁生物合成蛋白scdA，该蛋白参与细胞壁生物合成、细胞分裂和细胞壁周转等生命活动[23]。金黄色葡萄球菌能够合成顺乌头酸酶(Aconitase)，顺乌头酸酶的活性受到scdA的影响，在不含scdA或scdA表达量较低的金黄色葡萄球菌中，顺乌头酸酶的活性显著降低[24]。研究表明，顺乌头酸酶的减少会使TCA循环活性降低，而TCA循环又是为生物体提供能量，降低潜力和生物合成中间体的重要中枢代谢途径[25]。因此可以推测，scdA蛋白的表达与否、表达的量多量少，影响了顺乌头酸酶的TCA循环过程，导致金黄色葡萄球菌机体代谢产生异常，因而影响了金黄色葡萄球菌在不同环境中的生长量。

两种培养模式下scdA基因的mRNA相对表达量结果对比表明，无论SNP251050的核苷酸类型是G或A，其单独培养与混合培养下的相对表达量差异都极其显著，且两种培养模式下不同基因型的检测结果不显著。因此对于该显著SNP对应的基因及表达的蛋白，表型可塑性引起的适应变化要明显强于基因型不同引起的变化。另外，在G和A两种情况中，混合培养下的scdA表达量都要明显高于单独培养下的表达量。生长量统计结果表明金黄色葡萄球菌在混合培养下拷贝数显著降低，在混合培养生长中处于劣势，而mRNA相对表达量结果显示金黄色葡萄球菌菌株为保证自身存活，产生了一些生理反应，促使scdA基因的表达水平显著上升。scdA表达量的增加及其他相关基因表达量的增加，帮助金黄色葡萄球菌产生了更多相关功能蛋白，并得以维持其在培养体系中的稳定性。

在近30年时间里，表型可塑性的研究将生命体表型适应的生态学和生理学研究推进到了新的水平，并且得到了大量的实质性研究结果。本研究的表型可塑性实验比较了金黄色葡萄球菌微观生理层次不同表型的转化及其所对应不同特征的环境条件的响应，进一步阐明了表型可塑性理论的合理性，同时为微生物领域表型可塑性的研究提供了参考依据。