用于检测肼的小分子荧光探针的研究进展

朱俊龙，凌庆慧，刘 茜，徐 林

(华东师范大学 化学与分子工程学院 上海市绿色化学与化工过程绿色化重点实验室，上海 200062)

肼是生产农药、医药、聚合物、乳化剂和纺织染料等精细化学品的重要组分[1]。肼具有高可燃性和高燃烧焓，常用作导弹和卫星推进系统中的高能燃料,被称为“火箭燃料”。它还在某些类型的燃料电池中作为反应物起着关键作用。然而，这种广泛使用的化学物质具有致癌性和毒性[2]，容易被吸入和摄入而引起急性中毒，接触到皮肤会致癌和诱发突变，急性接触会对肝脏、肾脏和中枢神经系统造成严重损害，而长期接触会对脾脏、甲状腺和呼吸道造成严重伤害，还可能导致暂时性失明以及对DNA产生不利影响[3]。因此，美国环保署已将肼列为B2类化学品，规定允许的上限为10×10-9[4]。

迄今为止，科学家们已经发展了各种用于定性检测和定量测定肼的技术，包括色谱技术[5](如高效液相色谱[6]、气相色谱[7]和离子色谱[8])、色谱耦合质谱[9]、电化学方法[10](如毛细管电泳法[11]、电量分析法[12]、电位法[13]、电流分析法[14]、离子选择性电极法[15])以及滴定法[2]。这些方法大多数需要进行样品制备，处理时间较长并且设备昂贵复杂，因此现场监测肼非常困难。此外，由于这些方法是侵入性的，也难以实现对肼的体内监测和成像[16]。

小分子荧光探针具有成本低、易于合成、灵敏度高、特异性好、能够实时分析等特点而倍受关注[17-20]。因此，设计高选择性和高灵敏度的小分子荧光探针来检测痕量肼，受到越来越多人的关注[21]。迄今为止，N2H4荧光探针主要是基于肼的强亲核性，与修饰在荧光团上的识别基团反应。这些识别基团，在调节电子过程中起着重要作用，包括激发态分子内质子转移(excited—state intramolecular proton transfer，ESIPT)，光诱导电子转移(photoinduced electron transfer,PET)或分子内电荷转移(intramolecular charge transfer，ICT)[22-23]。虽然已有很多N2H4荧光探针相关文献[24-32]，但相关综述却鲜有报道。考虑到过去几年用于检测肼的小分子荧光探针研究取得了重要进展，因此，本文对该领域进行了系统的总结和综述。为了更好的理解，本文从荧光探针的检测机理方面进行分类阐述。

1 基于荧光团脱保护机理检测肼的小分子荧光探针

肼具有很强的亲核性，因此可以用于脱除荧光团上的识别基团，包括乙酰丙酰基[24]、4-溴丁酰基[25-27]、邻苯二甲酰亚胺基[28-29 ]以及乙酰基[ 30]等。

1.1 乙酰丙酰基作为识别基团的小分子荧光探针

乙酰丙酰基是有机合成中常用的保护基团，能选择性地与肼反应。基于此，Choi等[24]设计合成了修饰有乙酰丙酰基的香豆素衍生物1作为N2H4荧光探针。在含30%水、pH 4.5的DMSO溶液中，探针1在307和336 nm处有强度适中的紫外吸收峰以及在458 nm处有很弱的荧光发射峰。当加入肼后，在426 nm处有显著的吸收峰生成，同时，458 nm处的荧光发射增强了250倍，如图1所示。这是由于肼选择性脱去乙酰丙酰基后，生成的3-氰基-7-羟基香豆素具有特征性的黄绿色以及蓝色荧光，如图2所示。而当分别加入其它金属阳离子、阴离子时，吸收和发射谱基本没有变化，表明了探针1对肼的高选择性识别(见图1)。这一探针作为方便的信号传导工具，实现了在水环境中光学测定肼。

图1 肼(1.0×10-3mol·L-1)、金属离子(1.0×10-3mol·L-1)、阴离子(1.0×10-3mol·L-1)分别存在下，探针1(1.0×10-5mol·L-1)在醋酸缓冲液(pH=4.5，10 mmol·L-1)和DMSO的混合液中(3∶7，v/v)的吸收光谱(a)和发射光谱(b)(混合15 min后测试)Fig.1 UV-vis spectra (a)and fluorescence spectra (b)of probe 1 in the presence of hydrazine,representative metal ions,and anions.[1] = 1.0×10-5mol·L-1,[hydrazine] = [Mn+] = [An-]=1.0×10-3mol·L-1in a mixture of acetate buffer (pH=4.5,10 mmol·L-1)and DMSO (3∶7,v/v).Measured after 15 min of mixing

图2 乙酰丙酰化的羟基香豆素1对肼的信号转导Fig.2 Signaling of hydrazine by levulinated hydroxycoumarin 1

1.2 4-溴丁酰基作为识别基团的小分子荧光探针

4-溴丁酰基与肼反应的机理与乙酰丙酰基类似，因此也可以用作肼的识别基团。基于此，Goswami等[25]构筑了基于2-(2′-羟基苯)苯并噻唑(HBT)的比率型N2H4荧光探针2，利用4-溴丁酰基取代HBT的羟基氢，进而抑制HBT的ESIPT。当探针2接触肼后，经过SN2取代、环化、消除，得到脱保护的HBT，ESIPT得到恢复，如图3所示。随着肼的逐渐加入，探针2在285 nm处的吸收峰和368 nm处的发射峰降低，在343和458 nm处分别生成新的吸收峰和发射峰，但加入阴离子、金属离子和其它有机碱，探针2的吸收光谱和发射光谱基本没变化，如图4所示。此外，活细胞成像实验证明了探针2能够追踪细胞内痕量的肼。因此，该探针2可用于检测天然样品中产生肼的菌株，还可精确测定样品中肼的浓度。

基于同样的策略，Qian等[26]报道了一例新颖的比色型和红色荧光的探针3，如图5所示。这一“开启”型荧光探针在水溶液中加入肼后，最大吸收峰红移了117 nm，最大发射峰增强了约16倍，显示出良好的选择性和低的检测限，成功地检测到了活细胞中的肼，有望进一步用于检测组织和动物体内的肼。

同样利用4-溴丁酰基与肼的反应，Lu等[27]发展了具有双发射的比色荧光探针4，如图6所示。该探针在肼的存在下，627 nm处的荧光显著增强，而814 nm处的近红外荧光显著减弱，同时日光下颜色从蓝绿色转变成红色，如图7所示。利用双发射波长的显著变化，可以检测到最低0.38×10-9浓度的肼。相比于其他比率型近红外探针，该探针能在生理环境的pH下，在含有少量有机溶剂的水溶液中识别肼，同时也成功应用于在海拉细胞以及活鼠体内检测肼。

图3 探针2识别肼的机理Fig.3 Mechanism of the response of probe 2 to hydrazine

图4 随着肼(0～20 μmol·L-1)逐渐增加，探针2 (10 μmol·L-1)的紫外可见吸收光谱(a)和发射光谱(b)的变化(混合60 s后记录光谱)；(c)在肼和其他代表性的阳离子、阴离子、有机碱(20 μmol·L-1)存在下，探针2 (10 μmol·L-1)的荧光光谱(λex= 300 nm)Fig.4 Change of UV-vis spectra (a)and emission spectra (b)of probe 2 (10 μmol·L-1)with incremental addition of hydrazine (0～20 μmol·L-1),spectra were recorded after 60 s of each mixing,(c)fluorescence spectra of probe 2 (10 μmol·L-1)in the presence of hydrazine and other representative cations,anions,and organic bases (20 μmol·L-1each).λex= 300 nm

图5 探针3识别肼的机理Fig.5 Mechanism of the response of probe 3 to hydrazine

图6 探针4识别肼的机理Fig.6 Mechanism of the response of probe 4 to hydrazine

图7 在DMSO-H2O中(1∶4,v/v,PBS 20 mmol·L-1,pH=7.4;λem/ex= 627/580 nm,λem/ex=814/780 nm)，有肼(200 μmol·L-1)和无肼条件下，探针4 (10 μmol·L-1)的吸收光谱变化(a)和荧光光谱变化(b)，插图显示了在自然光下有肼和无肼条件下探针的颜色变化Fig.7 Absorption spectral changes (a)and fluorescence spectral changes (b)of probe 4 (10 μmol·L-1)in the absence and presence of hydrazine (200 μmol·L-1)in DMSO-H2O (1∶4,v/v,PBS 20 mmol·L-1,pH=7.4;λem/ex= 627/580 nm and λem/ex= 814/780 nm),inset showed the color change of probe with or without hydrazine in natural light

1.3 邻苯二甲酰亚胺基作为识别基团的小分子荧光探针

Cui等[28]设计合成了一例邻苯二甲酰亚胺修饰的甲基香豆素5，如图8所示。利用Gabriel肼解生成7-氨基-4-甲基香豆素和鲁米诺，实现了颜色从黄色到无色，荧光从480到420 nm，以及H2O2活化引发的化学发光，如图9所示。此外，这一独特的比色型、比率型以及化学发光型三重光信号探针无论在气态还是水溶液中都能精确检测肼。

基于Gabriel肼解的策略，Cui等[29]又将邻苯二甲酰亚胺修饰在萘酰亚胺上，得到了一例高选择性的N2H4荧光探针6，如图10所示。在肼的存在下，探针6能在2 min内实现荧光开启以及颜色从无色变为黄色。溶液中肼的检测限可达0.3×10-9，低于美国环保署规定的10×10-9的上限，同样气态肼的检测限也能达到111.7 mg·m-3。此外，活细胞成像实验进一步证明了探针6在实际应用中的潜在价值。

图8 探针5识别肼的机理Fig.8 Mechanism of the response of probe 5 to hydrazine

图9 在H2O/DMSO (3∶7,v/v)的混合溶剂中加入肼后，探针5的紫外-可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)的变化，(λex= 380 nm)，(c)在H2O/DMSO (3∶7,v/v)的混合溶剂中，在有肼(1.0 μmol·L-1)和无肼条下，探针5的荧光光谱；(d)探针5 (1.1 μmol·L-1,H2O/DMSO:3∶7,v/v)在420 nm处的荧光强度与480 nm处的荧光强度的比值，与肼的浓度的函数关系，室温下，探针与不同物质在H2O/DMSO (3∶7,v/v)混合溶剂中反应1 min后记录下光谱(λex= 380 nm)Fig.9 UV-vis (a)and FL emission (b)spectra changes of CF upon addition of hydrazine in H2O/DMSO (3∶7,v/v).λex=380 nm,(c)fluorescence spectra of probe CF (1.0 μmol·L-1)recorded without and with hydrazine (1.0 μmol·L-1)in an aqueous mixture (H2O/DMSO:3∶7,v/v),(d)the ratio changes of the fluorescence intensity (FI)at 420 nm verses 480 nm observed for CF (1.1 μmol·L-1in H2O/DMSO:3∶7,v/v)as a function of hydrazine concentration,each spectrum was recorded after reaction of the probe with the various species for 1 min in a mixture of H2O/DMSO (3∶7,v/v)at r.t.and obtained using excitation at 380 nm

图10 探针6识别肼的机理Fig.10 Mechanism of the response of probe 6 to hydrazine

图12 探针8识别肼的机理Fig.12 Mechanism of the response of probe 8 to hydrazine

1.4 乙酰基作为识别基团的小分子荧光探针

Zhang等[30]基于ICT机理和肼的亲核性，设计合成了一例乙酰基修饰的半花菁荧光探针7，用于检测水溶液和人血清样品中的肼，如图11所示。在肼的存在下，探针7的吸收和发射都发生明显改变(最大吸收从585 nm红移至690 nm，706 nm处的发射明显增强)。这一“开启”型近红外探针在生理环境的pH下具有高选择性和低的检测限(5.4×10-9)，并成功用于细胞成像和活鼠组织器官成像。

2 基于成环反应的小分子荧光探针检测肼

除了上述基于荧光团脱保护检测肼的小分子荧光探针，还有部分探针利用与肼发生成环反应来检测肼。

Lee等[31]制备了一例三氟乙酰丙酰基取代的萘酰亚胺探针8，其中三氟乙酰丙酰基作为肼的识别基团，在肼的诱导下成环得到绿色荧光化合物9，如图12所示。该探针具有低的检测限(3.2×10-9)和高的选择性(即使有其他胺类存在)。将探针8覆盖在TLC板上可以高选择性检测气态肼。此外，该探针还能在其他胺类和金属离子存在的海拉细胞中选择性检测肼。

Roy等[32]设计合成了分别基于芘和蒽的开启型荧光探针10和11。如图13所示，在肼的作用下，探针10和11与肼分别生成中间体10a′和11a′，然后在甲醇的亲核进攻下发生“Michael”加成分别得到10a和11a，荧光分别增强了83和173倍。如图14所示，与其他阳离子、阴离子和小分子相比，探针10和11均对肼有很高的选择性，同时最低检测限分别达到了5.4×10-9和7.7×10-9。

图13 探针10或11识别肼的机理Fig.13 Mechanism of the response of probe 10 or 11 to hydrazine

图14 25 ℃，pH=7.4时，在混合溶液中(H2O/MeOH,4∶1,v/v含1 % DMSO作为辅助溶剂，HEPES作为缓冲溶液)，在每个探针中加入不同的阳离子，阴离子和小分子(各100 μmol·L-1)，346 nm 激发下(狭缝宽度为3/3 nm)，探针10(10 μmol·L-1)的荧光光谱(a)和在367 nm激发下 (狭缝宽度为3/3 nm)探针11 (10 μmol·L-1)的荧光光谱(b)Fig.14 Fluorescence spectra of (a)probe 10 (10 μmol·L-1)with λexat 346 nm (slit widths 3/3 nm)and (b)probe 11 (10 μmol·L-1)with λexat 367 nm (slit widths 3/3 nm)along with spectral changes after addition of various cations,anions,and small molecules (100 μmol·L-1each)to each of the probes in mixed solvent media (H2O/MeOH,4∶1,v/v with 1% DMSO as a cosolvent,buffered with HEPES)at pH=7.4 at 25 ℃

3 结 语

本文总结了近几年来用于检测肼的小分子荧光探针，包括基于脱荧光团保护基和成环反应的反应型探针。利用荧光探针成本低、易于合成、灵敏度高、特异性好、能够实时分析等特点，实现了体外检测、细胞成像、组织成像甚至活体内成像。但是大部分探针需要与肼反应几min甚至几十min，因此快速、实时监测肼依然是个难题。另外体内分析检测肼仍处于开始阶段，依然需要研究者不断探索，特别是发展在复杂生理环境中性质稳定的肼探针。