蛹虫草培养基中多肽的提取分离工艺

雷燕妮， 张小斌*， 李多伟， 杨 梅

(1.商洛学院， 陕西 商洛 726000； 2.西北大学 生命科学学院， 陕西 西安 710069； 3.陕西富士金医药保健品有限责任公司， 陕西 西安 710075)

蛹虫草〔Cordycepsmilitaris(Fr.) Link.〕别名北虫草，属子囊菌亚门麦角菌科虫草属[1]，与冬虫夏草同属，是一种具有滋补作用的中药和营养品，含有大量的蛋白质、糖类、脂类、维生素和多种微量元素，及虫草素、虫草酸与超氧化物歧化酶(SOD)等各类生物活性物质，因此，具备提升免疫力、抗肿瘤和抗炎等功效[2-5]。杨爽等[6-7]研究发现，蛹虫草小分子肽具有抗肿瘤、增强免疫力及抗氧化损伤等特点。蛹虫草因其突出的功效与作用已被卫生部批准为新食品原料(2009年第3号)，其植物多肽良好的功效作用已日益受到广大消费者青睐，国内人工栽培面积不断扩大，已有大量药品、保健品及食品等深加工产品上市。目前，有关虫草素与虫草多糖的研究屡见不鲜，但鲜见对虫草蛋白与虫草多肽的研究报道。鉴于此，以蛹虫草培养基中多肽的含量为指标，采用双因素试验、单因素试验和正交试验相结合的方法[8]，对蛹虫草培养基多肽提取工艺进行探索，旨在为蛹虫草资源进一步开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1蛹虫草培养基由徐州鸿宇农业科技集团提供，西北大学生命科学和医学部鉴定。

1.1.2试剂99%牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司；乙醇、磷酸等化学试剂均为国产分析纯，市购；蒸馏水，自制。

1.1.3仪器设备 ME235S电子分析天平，德国Sartorius公司；201紫外可见分光光度计，美国FISHER公司；H-H-S21-6C电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂；RE-2000 A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-C循环水式多用真空泵，开封市宏兴科教仪器厂；101A-2鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；SB-4200DT超声清洗器，宁波新芝仪器设备有限公司；LD5-10高速离心机，北京医用离心机厂； KRT-TU-1812-3多功能膜设备，合肥科锐特环保工程有限公司；YC-1800实验室中药喷雾干燥机，上海雅程仪器设备有限公司；FZ102植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1材料预处理

1) 考马斯亮蓝G-250溶液制备。精确称量考马斯亮蓝G-250 100 mg，用50 mL 90%乙醇充分溶解，再加入100 mL 85%磷酸(W/V)，最后用蒸馏水定容至1 000 mL，均匀混合后置于棕色瓶内储存。该溶液室温保存有效期为30 d，使用前需用中性滤纸滤取溶液后再用。

2) 蛋白质标准溶液制备。称取牛血清蛋白(BSA)标准品25.0 mg，加水溶解并定容至100 mL (250 μg/mL)，从中吸取40 mL用蒸馏水稀释并定容至100 mL(100 μg/mL)得标准溶液，在4℃冰箱中保存备用。

3) 绘制蛋白含量标准曲线。参照文献[9-12]的方法采用紫外可见分光光度计法进行测定。取6支10 mL干净具塞试管，依次编号1～6，并设置1号试管为空白对照加入1 mL蒸馏水，其余5支试管依次添加0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL 牛血清白蛋白标准溶液，之后依次添加蒸馏水至1.0 mL。在检测过程中，所有试管添加5 mL考马斯亮蓝溶液，并混合均匀，放置2 min，于595 nm波长条件下开始检测，以蛋白含量(X)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，拟合蛋白质标准曲线。

1.2.2蛹虫草培养基多肽提取溶剂及提取方法的筛选采用双因素试验设计，即A提取溶剂(蒸馏水)，A1～A4pH依次分别为 6.5、7.5、8.5和9.5；B提取方法，B1～B2分别为热回流提取2.0 h，超声(20 kHz)提取1.0 h。精确称取蛹虫草培养基粉末8份各50.00 g，按1∶20料液比分别加入试验设计蒸馏水，浸泡1.0 h后在85℃水浴中分别热回流提取或超声提取，过滤取滤液，用稀酸或稀碱溶液调整滤液pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解温度下搅拌酶解4 h，用2 000 Da超滤膜过滤，滤除多糖、未水解彻底的大分子成分等，滤液再经反渗透膜浓缩，浓缩液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可见分光光度计测定多肽溶液的吸光度，并计算含量。

1.2.3蛹虫草培养基多肽的提取采用单因素试验设计，即P提取溶剂蒸馏水pH，P1～P4依次分别为pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5及pH 9.5；T提取时间，T1～T4分别为30 min、45 min、60 min和75 min；L料液比，L1～L4分别为1∶10、1∶15、1∶20和1∶25；C提取次数，C1～C4分别为1次、2次、3次和4次。按试验设计精确称取蛹虫草培养基粉末50.00 g各4份，分别置于2 000 mL烧瓶中，采用1.2.2中获得的最佳提取方式提取与过滤，滤液用稀酸或稀碱溶液调pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解温度下搅拌酶解4 h，用2 000 Da超滤膜过滤，滤除多糖、未水解彻底的大分子成分等，滤液再经反渗透膜浓缩，浓缩液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可见分光光度计测定多肽的吸光度并计算含量。确定不同提取条件下提取因素的变化范围，以及各因素的最佳参数。在此基础上采用L9(34)进行正交试验，分析提取溶剂、提取时间、料液比及提取次数对蛹虫草培养基内多肽提取的作用水平，进而找到最合适的提取条件。

1.3数据统计与分析

采用Excel 2003和Spss进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1蛹虫草培养基多肽的提取溶剂及提取方法

从图1看出，蛹虫草培养基多肽的超声法提取效果均优于相同条件下的热回流法，但二者均随提取溶剂pH升高呈先升后降趋势。其中，超声法和热回流法提取对蛹虫草培养基多肽的提取能力均为提取溶剂pH 8.5>pH 7.5>pH 9.5>pH 6.5。二者均以蒸馏水pH 8.5条件下的提取率最高，分别为22.28%和20.75%，超声法提取率较热回流法高7.37%。因此，后续试验确定采用蒸馏水pH 8.5超声提取法进行蛹虫草培养基多肽的提取。

图 1不同提取方法各溶剂浓度蛹虫草培养基多肽的提取率

Fig.1 Extraction rate of polypeptides from cordyceps militaris medium with different solvent concentrations

2.2不同因素处理蛹虫草培养基多肽的提取率

不同因素对蛹虫草培养基多肽提取率的影响存在差异。

2.2.1 提取溶剂pH超声提取蛹虫草培养基多肽的提取率随pH增加呈先升后降趋势，弱碱性水溶液有利于多肽的提出。最佳水溶液pH 8.5左右，其提取率为22.28%；其次pH 7.5，提取率为21.85%。

2.2.2 提取时间蛹虫草培养基多肽超声提取率随提取时间延长而增加，其中，45 min后多肽超声提取率增加缓慢，45～75 min超声提取率为22.28%～22.30%，时间的延长大大增加能耗和用工，造成生产成本的增加，故超声提取时间应控制在45～60 min为宜。

2.2.3 料液比蛹虫草培养基多肽超声提取率随提取料液比的增加而增高，料液比1∶15时提取率为21.46%，之后多肽超声提取率的增幅变小，1∶20～1∶25超声提取率为22.28%～22.31%，超声提取料液比的增加大大增加溶剂用量，并增加溶耗和后续浓缩的成本，造成生产成本的增加，故最佳超声提取料液比确定为1∶15为宜。

2.2.4 提取次数随提取次数的增加，提取2次、3次和4次蛹虫草培养基多肽的超声提取效果均较好，提取2次的提取率为22.28%，增幅较大，较提取1次(17.92%)提高4.36%；但提取次数超过2次后，提取率的增幅减小，提取3次和4次的提取率分别为22.32%和22.35%。超声提取次数增加会延长生产周期及增加溶剂的用量，增加生产成本，因此，超声提取次数以2次为宜。

2.3蛹虫草培养基中多肽提取率的正交试验

由2.2的结果确定水超声提取蛹虫草培养基多肽的L9(34)正交试验方案(表1)。其中，方案6蛹虫草培养基多肽的提取率最高，为22.26%；其次是方案5，为22.04%。从表2看出，A因素极差最大，B因素其次，D和C因素较小。表明，A因素对蛹虫草培养基多肽提取率的影响最大，随后为B因素、C因素和D因素。

方差分析结果显示，A因素F值为75.206 6(F0.05F)，表明，3个因素的变化对多肽提取率的影响无显著差异。按照不同因素k值的变化可知，A、B、C和D因素优选水平分别为2、2、2和2或1，即超声提取蛹虫草培养基中多肽的条件为A2B2C2D2或A2B2C2D1，提取溶剂(蒸馏水)pH 8.5，料液比1∶15，超声提取45 min，提取1～2次。

表1水超声提取蛹虫草培养基多肽的L9(34)正交试验方案与结果

Table 1 Orthogonal test scheme and results of L9(34) for extracting polypeptides fromC.militarisculture medium by ultrasound method

序号No.A(提取溶剂pH)Extraction solvent pHB(提取时间/min)Extraction timeC(料液比)Solid-liquid ratioD(提取次数/次)Extraction times提取率/%Extraction rate17.5301∶20319.6427.5451∶15221.3537.5601∶10119.3648.5301∶15121.8558.5451∶10322.0468.5601∶20222.2679.5301∶10217.3689.5451∶20118.5799.5601∶15318.05

表2 蛹虫草培养基中多肽提取率的直观分析

注：K，各因素某一水平结果之和；k，各因素某一水平结果之和平均值；S，偏差平方和。

Note:K, sum of results of a certain level of each factor;k, average sum of the results of a certain level of each factor;S, sum of squares of deviations.

3结论与讨论

试验结果表明，蛹虫草培养基多肽的超声法提取效果均优于相同条件下的热回流法，说明，超声提取法较传统热回流提取法节省溶剂消耗、节省生产用时和用工及操作简单。蛹虫草培养基多肽超声提取最佳工艺参数：用pH 8.5的蒸馏水为提取溶剂，料液比1∶15，超声提取45 min，提取1～2次。此技术条件下的提取率为21.85%～22.26%。该试验为蛹虫草的产业化开发使用奠定了良好基础，同时给蛹虫草超声提取提供了可借鉴的数据参考。