河西走廊地区幽门螺杆菌iceA、babA2基因分型与疾病关联性研究*

王 猛，韩 俭，周 伟，刘晔华，张富花，穆 红△

(1.天津市第一中心医院检验科，天津 300192；2.兰州大学病原生物研究所，兰州 730000；3.兰州大学第一医院感染科研究室，兰州 730000；4.甘肃省第二人民医院消化内科，兰州 730000 )

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种能够定植并侵袭人类胃黏膜上皮的革兰阴性螺杆菌，在世界范围内感染率超过50%，大部分感染Hp的患者无任何症状。现已确认其感染是胃肠道慢性炎症和消化性溃疡的主要致病因素，并与胃癌及黏膜相关性淋巴样组织(mucosa associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤的发生密切相关[1]。1994年WHO癌症研究中心将HP正式确定为Ⅰ类致癌因子。随着国内外不断关注，大量研究现已证实Hp存在高度的基因多样性及变异性，并且其特点与一些疾病的进展和病程结局的转归存在密切关联[2]。因此，研究Hp基因多样性能为其感染相关消化道疾病的诊治、预后判断及预防提供重要的支持依据。

近些年国内外关于Hp基因多样性的研究主要集中于空泡毒素vacA和细胞毒素相关蛋白cagA这两个基因[3]。目前，上皮细胞接触诱导基因(induced by contact epithelium gene A,iceA)和血型抗原Lewis b结合黏附基因A(blood group antigen Lewis b binds to the adhesive gene A,babA)也逐渐得到关注，iceA基因分为iceA1型和iceA2型。有研究认为iceA1基因型与消化性溃疡的发生发展关联密切，而iceA2基因型则与慢性胃炎及胃癌有关。BabA蛋白可辅助Hp通过人血型抗原Lewis B黏附胃上皮细胞，由babA基因编码[4]，分为babA1型和babA2型，二者基因序列同源，仅是babA2存在10 bp的插入基因序列，可以形成信号肽序列的翻译起始点，故仅有babA2基因型具有生物活性[5]。

目前关于Hp基因iceA、babA的研究国外报道较多，我国的报道主要集中在浙江、上海、广东等地区，关于iceA、babA的研究逐步成为热点。甘肃河西走廊地区(兰州、张掖、金昌、武威)是我国胃癌高发地区，该地区上消化道疾病患者中Hp的检出率高达81.3%[6]。本研究旨在探讨甘肃河西走廊地域流行Hp 基因iceA、babA的基因多样性及在不同疾病患者中的分布状况，以期探明河西走廊地区Hp iceA、babA的流行特点，并为该地区Hp感染相关疾病的预疗提供必要的研究支持。

从概念的应用看，第一学段主要在于做有关平行四边形的拼图，第二学段多运用平行四边形的文字定义，与长方形、正方形等图形建立联系，有一定的抽象和推理要求，第三学段则将定义应用于严格的演绎推理．

1 资料与方法

1.1一般资料 Hp菌株于2016年1月至2018年1月采自甘肃省第二人民医院(兰州市)(16株)、张掖市人民医院(19株)、武威市肿瘤医院(17株)及金川公司职工医院(21株)的82例胃镜检查患者的胃黏膜，共分离73株Hp，以上临床分离的Hp菌株及Hp ATCC26695均已为实验室保存。患者入选标准：(1)胃镜诊断疾病(胃部炎症、消化性溃疡及胃部肿瘤)；(2) 患者年龄20～70岁；(3)患者取标本前2周内未服用抗生素。分离胃黏膜均获得上述患者同意，所有患者的临床诊断均为病理及胃镜明确诊断。最终选取诊断病例为浅表性胃炎24例、萎缩性胃炎23例、消化性溃疡17例、胃癌9例，并记录患者的临床信息。

2.2不同病理类型的患者中Hp iceA、babA2基因型的分布情况 在Hp感染的上消化道疾病患者中，浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡患者体内的Hp 以iceA1基因型为主(P<0.05)，胃癌患者体内Hp 以iceA2基因型为主(P<0.05)；消化性溃疡、胃癌患者体内Hp babA2基因型比例明显高于浅表性胃炎、萎缩性胃炎患者，差异有统计学意义(P<0.05)。73株Hp在不同病理类型患者中的分布情况，见表3。

1.2.3Hp分离培养及鉴定 将胃黏膜均匀涂抹在制备的Hp培养基上，于Hp培养盒37 ℃微需氧条件下(85%N2、10%CO2、5%O2)培养3～5 d；培养后观察菌落形态、生化反应(氧化酶、触酶、尿素酶)以及革兰染色涂片确认Hp菌株，并将其于-80 ℃保存备用。

1.2.2Hp培养基配置 哥伦比亚琼脂中按比例加入选择剂(万古霉素10 mg/L、两性霉素B10 mg/L、多粘菌素 2 500 U/L、甲氧苄啶5 mg/L)、10%葡萄糖及7%新鲜脱纤维蛋白羊血制成Hp培养基。

1.2.1试剂及仪器 哥伦比亚琼脂粉购自美国BD公司，脱纤维蛋白羊血购自甘肃省人民医院，Hp选择剂中两性霉素B购自北京索莱宝，万古霉素购自美国Sigma公司，甲氧苄啶购自加拿大BBI公司；Hp培养盒、微需氧产气袋购自日本三菱公司。Hp验证试剂中氧化酶试纸、触酶试剂购自兰州耐滴生物公司，尿素酶试剂购自福建三强公司；核酸提取试剂盒、引物、PCR反应试剂盒、琼脂糖购自美国HydraGene公司，电泳Marker DL2000购自大连宝生物TaKaRa公司，EB购自上海生工公司，-80 ℃冰箱购自美国Thermo公司，纯水仪、超净台、生物安全柜购自香港Heal force公司，灭菌高压锅购自上海三申公司，恒温温箱购自美国Thermo公司，显微镜购自日本奥林巴斯公司，低温高速离心机购自美国Thermo公司，PCR仪购自美国ABI公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，全自动凝胶成像分析系统购自上海嘉鹏科技公司。

1.2方法

1.2.5Hp引物设计及扩增 Hp iceA、babA2分型基因引物序列和扩增条件参照文献[7]。引物序列见表1。PCR反应体系为25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 2 μL，Hp模版1 μL， Taq DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。扩增条件为94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，iceA 55 ℃退火1 min(babA 57 ℃退火1 min)，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min。扩增结束后将扩增产物置于1.5%琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析系统中观察。以Hp 26695为阳性对照菌株，ddH2O为阴性对照。

2.1河西走廊地区Hp菌株iceA、babA2基因型在患者中的分布 河西走廊地区iceA、babA2基因型检测结果显示，73株Hp iceA基因扩增均为阳性，其中iceA1型56株(76.71%)，iceA2型17株(23.29%)；babA2基因型28株(38.36%)。20～<41、41～<61岁年龄组患者中，Hp iceA1型感染率均明显高于iceA2型(P<0.05)；61～70岁患者中Hp iceA2型感染率明显高于61岁以下各年龄段人群(P<0.05)。不同性别患者iceA基因型及Hp babA2基因型比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Hp iceA、babA2基因型在患者中的分布，见表2。Hp iceA1、Hp iceA2基因型电泳结果见图1、2。

1.2.4Hp模版DNA制备 复苏保存的73株Hp菌株及标准菌株ATCC26695，于磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗2次，经核酸提取试剂盒提取Hp核酸DNA，于-80 ℃保存备用。

表1 Hp iceA、babA2引物序列

1.3统计学处理 数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

[9][40][43][45][47][53][54][55][56] 刘修岩、李松林、秦蒙：《城市空间结构与地区经济效率——兼论中国城镇化发展道路的模式选择》，《管理世界》2017年第1期，第51-64页。

图1 iceA1基因型PCR电泳结果

图2 babA2基因型PCR电泳结果

表2 Hp iceA、babA2基因型在患者中的分布[n(%)]

a：P<0.01，b：P<0.05，与61～70岁比较

③铂铬合金支架：波士顿科学（Promus支架），说明书指出支架植入术后可立即性核磁共振检查，但建议静态磁场强度3T或以下；最大全身平均比吸收率为2.0W/Kg或更低；扫描可持续15 min；静态磁场梯度＜14 T/m。

研究获取的POI数据是现实空间地理实体的抽象，所以原始数据并没有考虑实体对象的规模，比如高等院校和鞋帽皮具店之间的规模可能就有很大差异，如果一个地区这两种类型POI点的数量相等，忽略它们规模上的差异就计入统计结果，就会对识别功能区产生一定的影响。因此考虑不同类型POI数据的规模并对原始POI数据类型进行重新整理后，得到新的POI数据分类表（表1）。

表3 不同病理类型患者中Hp iceA、babA2基因型分布状况

a：P<0.01，b：P<0.05，与胃癌比较；c：P<0.05，与消化性溃疡比较

3 讨 论

自WARREN等[8]于1983年从人体胃黏膜中成功分离出Hp以来，世界范围内便开启了关于Hp研究的序幕。在胃肠道疾病的众多致病因素中，现已确认Hp为重要致病因素[3]。Hp主要通过其毒力因子致病，vacA、cagA等毒力因子于前些年得到广泛的关注[3]，而关于Hp毒力因子iceA和babA的研究则相对较少，近年来iceA和babA也逐渐成为研究热点[9]。有研究结果发现，Hp iceA与乳酸奈瑟菌限制内切酶具有一定的同源性[10]；又有ABU-TALEB等[11]发现大部分Hp菌株iceA1并不是编码功能蛋白，而是在转录水平上对其下游HpyIM基因的表达进行调节，调节主要通过DNA甲基化水平的改变来调控相关毒力的表达，从而对Hp的致病作用有着间接调节的影响。YAKOOB等[12]研究发现，iceA是独立于vacA、cagA的毒力因素，其与消化性溃疡和白细胞介素8(IL-8)介导的黏膜厚度改变有关联。而iceA的基因多样性具有明显的地域差异，美洲、欧洲国家分离的Hp菌株iceA基因型主要以iceA2型为主[10]，南欧地区iceA2型检出率为66.2%[13]。FELICIANO等[14]研究发现，南美古巴地区Hp iceA2型的检出率为57.3%；而在亚洲iceA分型则以iceA1型为主。KABAMBA等[15]研究发现，在韩国、日本分离出的Hp以iceA1型为主要基因型。我国上海iceA1型检出率为74.5%[5]、西安iceA1型的检出率为76.1%[10]，这与本研究中iceA1型检出率为76.71%相似。但内蒙古地区有报道显示iceA1型的检出率则为53.04%[16]，存在一定的差异性，这可能与采样的人群结构有关，结果还需进一步论证。本研究中20～<41、41～<61岁的患者及浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡等病理类型组的Hp iceA基因型均以iceA1型为主，这和上述研究结果基本保持一致[13-16]。胃癌患者Hp主要以iceA2型为主，这也与国外部分研究结论相一致，但由于本研究中纳入的胃癌组标本量比较少，还需要继续增大标本量才能做出明确的研究论断。

Hp babA基因编码的蛋白质相对分子量约为78×103，babA基因有babA1、babA2两型基因， babA2较babA1在信号肽区多一个10 bp碱基的插入序列从而能够形成起始密码子启动转录，故只有babA2类型具有活性[17]。本研究中babA2的检出率为38.36%，各年龄段组、性别组人群中分布大致相同，而消化性溃疡、胃癌组babA2的检出率明显高于浅表性胃炎、萎缩性胃炎患者(P<0.05)，这一结果与伊朗[18]及上海[5]等地研究结果基本一致，但是与西安[19]报道的研究结果存在差异。这进一步证明了患者感染是Hp分布的多样性、致病机制的复杂性及环境和宿主关联性的综合结果，需要与Hp相关的研究的进一步延伸讨论。

河西走廊作为我国通往西方的“古丝绸之路”的重要部分，研究该地区Hp iceA、babA2基因的分布对探索东、西两方Hp菌株的遗传多样性和上消化道感染疾病的致病机制有着非凡的意义。现已有研究发现，河西走廊地区上消化道疾病中胃癌高发，且病例中存在较高的Hp感染率[20]。本研究结果发现，河西走廊地区流行的Hp菌株中iceA基因均为阳性，并且以iceA1型为主，Hp iceA基因型分布与患者的疾病类型及患者年龄有关，但与患者性别无明显关联性；河西走廊地区流行的Hp菌株babA2基因型感染较多发生于消化性溃疡、胃癌患者，并同其他地区相关研究一致。

福建省在国家防办制定的实施方案编制大纲基础上，制定了福建省建设实施方案编制大纲，监测预警系统建设技术要求，防御宣传手册、宣传栏、警示牌样式和防御预案编制要求和范本等。这些技术标准明确了“构建监测预警网络和群测群防的防御体系，完善‘预警到乡、预案到村、责任到人’工作机制，实现有效防御山洪灾害，保障人民群众生命安全，最大限度减轻山洪灾害损失”的建设目标；规范了建设任务、建设内容和概算编制要求等；体现了具有福建特色的项目总体要求和技术方案，为各地编制实施方案奠定了良好基础。

综上所述，本研究为河西走廊地区Hp遗传多样性、疾病预防控制的研究提供了相对应的数据，可为 Hp iceA、babA2基因与患者感染的致病关系、疾病发展及转化机制等提供进一步深入研究、探讨的方向。