miR-21可通过下调CCL20减轻心肌炎的炎性反应抑制心肌细胞凋亡

李阳春 张敏 雷蓉

(川北医学院附属医院 1心血管内科，四川 南充 637000；2健康管理中心)

病毒性心肌炎(VMC)是由病毒侵袭心脏而引起心肌炎症为主的心血管疾病〔1〕。该病可由多种病毒引起，其中有艾可(ECHO)病毒、柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组均可导致VMC，最常见的是由柯萨奇B组3型病毒(CVB3)引起的心肌病变，且其多发于青年和儿童〔2〕。病毒感染后会引起机体发生一系列的炎性反应，激活机体凋亡相关基因，诱导凋亡。该病的治疗主要针对病毒感染和心肌炎症。多数患者经治疗后可痊愈，但仍有部分患者会在急性期死亡。微小(mi)RNA为一类长度在19～25个核苷酸的内源单链小分子RNA，其表达具有组织特异性〔3〕。研究显示，miRNA在病毒与宿主细胞的相互作用中发挥重要用〔4〕。但miR-21在心肌炎细胞中的作用机制尚不清楚。人巨噬细胞炎性蛋白3α(CCL20)为CC家族趋化因子中重要的成员之一，与其他趋化因子不同，其受体为趋化因子受体(CCR)6分子，主要分布在树突状细胞(DC)、效应T细胞、记忆T细胞和B细胞表面〔5〕。研究显示，CCL20在VMC患者中高表达〔6，7〕，但其具体的作用机制尚不完全清楚。本研究观察过表达miR-21、沉默CCL20对心肌炎患者巨噬细胞中白细胞介素(IL)-17及心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 健康志愿者、心肌炎患者心肌细胞、心肌炎患者巨噬细胞购自ATCC；siNC、siCCL20、miR-21 mimics、pcDNA 3.1购自索莱宝公司；CCL20定量检测试剂盒购自江苏江莱公司；IL-17酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海钰博公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自吉满生物。

1.2细胞培养 用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基于37℃，5%CO2的培养箱中培养健康志愿者、VMC患者巨噬细胞，细胞生长至对数期用于实验；用含10% FBS的DMEM培养基于37℃ 5%CO2的培养箱中培养健康志愿者、VMC患者心肌细胞，待细胞融合度达到70%～80%时，传代培养，至第3～8代用于实验。

1.3细胞转染 将miR-21 mimimcs、miR-NC转染至VMC患者巨噬细胞、心肌细胞，标记为miR-21 mimics组、miR-NC组，未做任何处理的VMC患者巨噬细胞、心肌细胞标记为NC组，siCCL20、siNC转染至VMC患者巨噬细胞、心肌细胞标记为siCCL20组、siNC组，未做任何处理的VMC患者巨噬细胞、心肌细胞标记为NC组，将miR-21 mimics+pcDNA 3.1、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20转染至VMC患者心肌细胞，标记为miR-21 mimics+pcDNA 3.1组、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20组，以上各组均采用脂质体法转染，转染成功后备用。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验 将对数生长期1.3各转染组细胞，用Trizol法提取细胞样本总RNA，并定量。按照逆转录反应试剂盒说明书合成模板链cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书操作步骤要求进行miR-21的测定。反应结束后分析Ct值，以2-△△Ct法计算定量结果，测定miR-21的相对表达水平。每个样品重复3次，取平均值。

1.5ELISA 按照CCL20定量检测试剂盒、IL-17 ELISA检测试剂盒检测对数生长期1.3各组细胞中CCL20、IL-17的含量。

1.6Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验 将1.3各转染组细胞，用结合缓冲液500 μl悬浮，分别加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪分析测定结果：细胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.7双荧光素酶报道基因检测实验 取适量对数生长期1.3各组细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，以psiCHECK2-CCL20-3′非翻译区(UTR)野生型(WT)和psiCHECK2-CCL20-3′UTR突变型(MUT)的表达为对照，观察miR-21对CCL20表达的影响。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-21和CCL20在VMC患者中的表达 与健康志愿者相比，VMC患者心肌细胞中miR-21表达显著降低(P<0.001)，血清中CCL20的含量显著升高(P<0.01)，见表1。

表1 miR-21和CCL20在VMC患者中的表达

2.2过表达miR-21对VMC患者巨噬细胞中IL-17 与NC组、miR-NC组相比，miR-21 mimics组miR-21表达显著升高，IL-17含量显著降低，细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)，见表2。

2.3沉默CCL20对VMC患者巨噬细胞IL-17水平及心肌细胞凋亡的影响 与NC组、siNC组相比，siCCL20组CCL20表达、IL-17水平、细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)，见表3。

表2 过表达miR-21下调VMC患者巨噬细胞IL-17水平、心肌细胞凋亡

与NC组比较：1)P<0.05；与miR-NC组比较：2)P<0.05

表3 沉默CCL20下调VMC患者巨噬细胞IL-17水平、心肌细胞凋亡

与NC组比较：1)P<0.05；与siNC组比较：2)P<0.05

2.4CCL20是miR-21的靶基因 通过TargetScan对miR-21和CCL20进行预测，发现miR-21和CCL20存在互补序列(图1)。将CCL20-WT、CCL20-MUT转染心肌细胞，标记为CCL20-WT组、CCL20-MUT组，未做任何处理的心肌细胞标记为NC组。与miR-NC组相比，转染miR-21 mimics的CCL20-WT组心肌细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。见表4。可见，CCL20是miR-21的靶基因。

图1 CCL20的3′UTR中含有与miR-21互补的核苷酸序列

组别NCCCL20-WTCCL20-MUTmiR-NC组1.48±0.181.52±0.191.51±0.15miR-21 mimics组1.47±0.160.52±0.091.53±0.13t值0.0728.2390.175P值0.9460.0010.870

2.5过表达CCL20可逆转miR-21对VMC患者心肌细胞凋亡的抑制作用 与miR-NC组〔(9.24±0.67)%〕相比，miR-21 mimics组细胞凋亡率〔(4.12±0.39)%〕显著降低(P<0.05)；与miR-21 mimics+pcDNA 3.1组〔(3.97±0.26)%〕相比，miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20组细胞凋亡率〔(9.17±0.74)%〕显著升高(P<0.05)。可见，过表达CCL20可逆转miR-21对VMC患者心肌细胞凋亡的抑制作用。

3 讨 论

miRNAs由一类小型非编码RNA组成，可控制互补目标信使RNA表达〔8〕。miRNA在进化上高度保守，通过与靶基因3′UTR相结合从而抑制靶基因的翻译或使其降解〔9〕。研究证实miRNA参与细胞的增殖、分化及凋亡等过程，与肿瘤、心脏等疾病的发生发展密切相关，在心肌肥厚、心肌纤维化、心律失常和心力衰竭中均具有重要作用〔10〕。Thum等〔11〕在衰竭心脏成纤维细胞的研究中发现miR-21高表达，且沉默miR-21可通过失活胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAP)抑制间质纤维化，减弱心脏功能，提示miR-21可作为心力衰竭疾病治疗的靶点。何进等〔12〕在心肌炎的研究中构建CVB3诱导的VMC小鼠模型，并检测模型小鼠心肌组织中10种miRNA的表达，揭示miR-92a、miR-126-5p、miR-199a、miR-210、miR-208表达上调，miR-21、miR-320表达下调，且这些异常表达的调控与心肌细胞周期、迁移、凋亡及血管生成均相关。本研究与前人研究结果相吻合，验证了miR-21可靶向结合CCL20，且过表达CCL20可逆转miR-21对VMC患者心肌细胞凋亡的抑制作用。

心脏受病毒侵袭后会引起一系列的病理生理变化，如氧化应激、能量代谢障碍、炎性因子的分泌、线粒体结构和功能的改变等，甚至发生心肌细胞凋亡、坏死〔13〕。心肌细胞为不可再生的终末分化细胞，因此在心脏病中可逆性的抑制心肌细胞凋亡将保护心肌细胞免受损，得益于心脏〔14〕。颜雯等〔15〕研究报道，在VMC中，心肌细胞的凋亡水平明显升高，且雷米普利可抑制VMC中心肌细胞的凋亡，提示雷米普利可用于VMC的治疗。本研究提示过表达miR-21、沉默CCL20对心肌细胞具有保护作用。

炎症为机体损伤和抗损伤的统一过程，其中损伤因子(细菌、病毒等异物)可直接或间接造成组织和细胞的损伤，也可通过炎症充血和渗出反应，以稀释、杀伤和包围损伤因子〔16，17〕。IL-17 是由活化的T 细胞产生的致炎因子，其可激活T 细胞，刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生IL-6、IL-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞黏附分子(CAM)-1，从而导致炎症的产生〔18，19〕。心肌炎患者最显著的特征为心肌细胞中炎性因子分泌增加，严重者可至心肌坏死。Yuan等〔20〕在急性病毒性心肌炎的研究中构建了CVB3诱导的BALB/c小鼠急性病毒性心肌炎(AVMC)模型发现，小鼠脾脏Th17细胞、血清IL-17、心脏IL-17 mRNA表达显著升高，并伴有AVMC心脏损伤，IL-17可中和分泌抗病毒细胞因子干扰素(IFN)-γ的Th1和CD8+T细胞的表达，上调脾Th1和CD8+T细胞和心脏IFN-γ mRNA水平，使病毒复制减少，心肌炎性细胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β的含量均减少，揭示Th17细胞参与了AVMC中CVB3的复制，IL-17可能是调节抗病毒免疫平衡的重要靶点。本研究发现，过表达miR-21、沉默CCL20均可下调心肌巨噬细胞中IL-17的含量。

综上，miR-21可降低CCL20表达减轻心肌炎的炎性反应，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能与靶向CCL20有关，为急性心肌炎的治疗提供靶点。