青葙皂苷对小鼠心肌梗死的保护作用及机制研究*

彭 晖，奚群英，徐长福，沈盛晖，马彩艳，童 鸿

(浙江省立同德医院心血管科，杭州 310012)

随着经济水平的不断提高和社会老龄化，心血管疾病的发病率不断攀升，在心血管疾病中急性心肌梗死已成为引起人类死亡的第一大原因[1]。急性心肌梗死是在冠状动脉狭窄的基础上发生血管急性闭塞，导致心肌供血持续减少，产生心肌缺血和坏死，常并发恶性心律失常、室间隔穿孔、心脏破裂甚至猝死等一系列严重的心血管事件。虽然传统的药物治疗、介入治疗和外科搭桥手术等可以重建血运，挽救部分缺血区域的心肌，一定程度上改善心肌梗死患者的预后。即使患者在急性期未死亡，已坏死的心肌细胞无法再生，会逐渐被瘢痕组织代替，发生室壁变薄、心腔扩大、左心室重构等一系列病理改变，导致心肌功能失代偿，绝大多数患者最终发展成慢性心力衰竭[2]。因此，研究开发治疗心肌梗死及改善心肌重构的药物临床意义重大。青葙子(Celosiae Semen)来源于苋科青葙属植物青葙(Celosia Argentea L.)的成熟种子，干燥后入药。青葙子在许多经典医药典籍和中国药典中均有记载[3]，具有清肝明目的功效，主治视力模糊、肝火眩晕、眼生翳膜、肝热目赤等症状。青葙皂苷(Celosins)是从青葙子中分离纯化得到的五环三萜皂苷类化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、A、B、C、D、E、F和G 9种化合物，其中青葙皂苷Ⅰ、Ⅱ是其主要成分，发挥主要的药理学作用[4]。最近研究表明，青葙皂苷可抑制小鼠动脉粥样硬化斑块巨噬来源泡沫细胞的形成及增加胆固醇流出，提示青葙皂苷在心血管疾病的防治中也具有积极作用[5]。青葙皂苷是否对心肌梗死具有心肌保护作用尚少有报道。本文通过建立小鼠急性心肌梗死模型探讨青葙皂苷对急性心肌梗死的保护作用及其机制，为其进一步临床开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 无特定病原体级 (SPF级) C57/B6雄性小鼠100只，8～10周龄，体质量(20±2)g，由温州医科大学实验动物中心提供，使用许可证号为 SYXK(浙)2015-0009。实验正式开始前先适应性饲养1周，动物房温度(25±1)℃，相对湿度(40±5)%，光照周期10～12 h，用标准小鼠颗粒饲料喂养，自由饮用纯净水。

1.1.2实验药物 青葙皂苷由本实验室自制，方法如下：精密称取青葙子药材1 000 g，常规粉碎，40目过筛后置于2 L锥形瓶，加10倍量50%甲醇，浸泡12 h，超声提取2次，每次30 min。合并提取液，减压浓缩，干燥，得青葙皂苷7.2 g。经高效液相色谱-蒸发光散色检测，青葙皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量之和为81.2%。给小鼠灌胃时以5%西黄蓍胶(m/v)水溶配成混悬液，摇匀后使用。

1.1.3主要试剂 戊巴比妥钠(美国Sigma公司)，冠状动脉结扎线(宁波成和公司)，心肌肌钙蛋白T(cT-nT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；白细胞介素(IL)-1β和IL-18检测试剂盒(上海博湖生物科技发展有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(南京建成生物工程研究所)，RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和BCA 蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、隐热蛋白(NLRP3)、凋亡相关点样蛋白(ASC)和Caspase-1 p45羊抗鼠抗体(美国Abcam公司)，β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(IgG-HRP)和电化学发光(ECL)显色液(碧云天生物技术有限公司)。

1.1.4主要仪器 小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)，Vevo 2100 高分辨小动物超声影像系统(加拿大Visual sonics Inc公司)，快速组织细胞破碎仪(无锡沃信仪器有限公司)，Thermo CL31R型离心机和MK3 酶标仪(美国 Thermo 公司)，电泳装置和转膜装置(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分组与给药 100只C57/B6小鼠随机分为5组(n=20)，分别为正常对照组、模型对照组、青葙皂苷小剂量(10 mg·kg-1·d-1)组、青葙皂苷中剂量(30 mg·kg-1·d-1)组和青葙皂苷大剂量(90 mg·kg-1·d-1)组[6]。青葙皂苷小剂量组、青葙皂苷中剂量组和青葙皂苷大剂量组分别灌胃给予10、30、90 mg·kg-1·d-1青葙皂苷，正常对照组和模型对照组C57/B6小鼠灌胃给予同体积的5%西黄蓍胶溶液。各组C57/B6小鼠造模前1周开始给药，造模后继续给药4周。

1.2.2心肌梗死模型的建立 将80只C57/B6小鼠按体质量用1%戊巴比妥钠溶液经腹腔麻醉，以小动物呼吸机辅助呼吸。胸部去毛，消毒。胸骨左缘纵行切开皮肤1.5 cm，逐层分离掀开胸大肌，左侧第4、5肋骨打开胸腔暴露心脏。钝性撕开心包在左心耳下缘2～3 mm处结扎冠状动脉左前降支，可立即见结扎线以下心肌组织泛白发绀，确认心肌梗死模型建模成功后维持血管结扎，迅速将心脏送回胸腔，用双手食指挤压出胸腔内的血液和气体，然后依次缝合胸骨、肌层及皮肤。待小鼠恢复自主呼吸后送回鼠笼饲养。正常对照组C57/B6小鼠只穿线不结扎冠状动脉左前降支，其余步骤均同心肌梗死组制备。

1.2.3心脏超声检测 各组C57/B6小鼠于造模4周时用1%戊巴比妥钠溶液麻醉，取仰卧位，使用Vevo 2100检测左室收缩末期内径(LVESD)和左室舒张末期内径(LVEDD)，由超声心动图电脑自动计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)，取连续6个心动周期的平均值。

1.2.4酶联免疫吸附测定 各组C57/B6小鼠超声检查结束后眼眶取血1 mL，室温下静置30 min，4 ℃下离心(3 500 r/min离心5 min)， 分离得血清。按照IL-1β、IL-18、cT-nT、CK-MB和LDH试剂盒说明书操作，应用双抗体夹心法测定血清IL-1β、IL-18、cT-nT、CK-MB和LDH水平。

1.2.5心脏梗死面积测定 各组C57/B6小鼠采血后随机取10只，尾静脉注射1 mL伊文思蓝(0.1 g/mL)，1 min后开胸迅速取出小鼠心脏，于-20 ℃储存20 min，延纵轴切4～5个切片，每个切片1.0～1.5 mm。将每个切片用载玻片压制成片，置于1% TTC染液于37 ℃下染色30 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定。梗死心脏区为白色，非梗死区为红色。用数码相机获取图像，并应用Image J软件计算梗死面积=梗死面积/(梗死面积+非梗死面积)×100%。

1.2.6Western blot检测 各组剩余10只C57/B6小鼠脱颈椎处死后立即开胸取心脏，将血液挤干净，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，切下大鼠左心室并切成米粒大小，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，进行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜。用5%脱脂奶粉(磷酸化抗体用4%牛血清清蛋白)封闭2 h，分别加入NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1 p45和β-actin一抗，4 ℃下孵育过夜。PBST溶液洗膜3次，加入IgG-HRP，室温避光孵育1 h，PBST洗膜3次。加ECL液曝光、显影、定影。用扫描仪扫描曝光胶片，用Image J软件分析条带灰度值。

2 结 果

2.1各组小鼠心功能指标的比较 模型对照组小鼠LVESD和LVEDD均较正常对照组显著升高(P<0.05)，LVEF和LVFS均较对照组显著降低(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠LVESD和LVEDD，升高LVEF和LVFS，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1。

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05，与模型对照组比较；c：P<0.05，与青葙皂苷低剂量组比较；d：P<0.05，与青葙皂苷中剂量组比较

图1各组小鼠心肌梗死4周时心功能指标的比较(n=20)

2.2各组小鼠血清心肌损伤标记物水平的比较 模型对照组小鼠血清cT-nT、CK-MB和LDH水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠血清cT-nT、CK-MB和LDH水平，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图2。

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05，与模型对照组比较；c：P<0.05，与青葙皂苷低剂量组比较；d：P<0.05，与青葙皂苷中剂量组比较

图2各组小鼠心肌梗死4周时血清心肌损伤标记物水平的比较(n=20)

2.3各组小鼠血清炎性指标水平的比较 模型对照组小鼠血清IL-1β和IL-18水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠血清IL-1β和IL-18水平，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图3。

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05，与模型对照组比较；c：P<0.05，与青葙皂苷低剂量组比较；d：P<0.05，与青葙皂苷中剂量组比较

图3各组小鼠心肌梗死4周时血清炎性指标的比较(n=20)

2.4各组小鼠心肌梗死面积的比较 正常对照组小鼠无心肌梗死区域(白色区域)，而模型对照组小鼠有梗死区域。青葙皂苷可抑制心肌梗死小鼠的心肌梗死面积，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图4。

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05，与模型对照组比较；c：P<0.05，与青葙皂苷低剂量组比较；d：P<0.05，与青葙皂苷中剂量组比较

图4各组小鼠心肌梗死4周时心肌梗死面积的比较(n=10)

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05，与模型对照组比较；c：P<0.05，与青葙皂苷低剂量组比较；d：P<0.05，与青葙皂苷中剂量组比较

图5各组小鼠心肌梗死4周时NF-κB-NLRP3信号通路相关蛋白水平的比较(n=10)

2.5各组小鼠心肌梗死4周时心肌NF-κB-NLRP3信号通路相关蛋白水平的比较 模型对照组小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。青葙皂苷可抑制心肌梗死小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白表达，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图5。

3 讨 论

心肌梗死是导致心血管疾病患者死亡最主要的原因之一[6]。深入研究心肌缺血损伤的干预靶点和治疗措施很有必要。现代植物化学研究显示，青葙子的化学成分包括甾醇、有机酸、环肽和皂苷等化合物，其中青葙皂苷是其主要有效成分。体内体外研究显示富含青葙皂苷的提取物可显著减轻高脂血症、高血糖、氧化应激和急性肝损伤，对非酒精性脂肪肝病也具有一定保护作用[7-9]。最近研究表明，青葙皂苷可抑制小鼠动脉粥样硬化斑块巨噬来源泡沫细胞的形成及增加胆固醇流出，提示青葙皂苷在心血管疾病的防治中也具有积极作用[5]。体内研究显示，青葙皂苷可通过增加自噬体数量、降低动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块相对面积，而发挥治疗作用[10-11]。体外研究显示，青葙皂苷可显著降低巨噬细胞对脂质的吞噬作用和泡沫细胞形成率，其作用可能与下调清道夫受体B3、A1 mRNA表达，上调三磷腺苷结合盒转运体A1、G1 mRNA表达以及自噬特异性蛋白微管相关蛋白轻链3和beclin 1相关，从而促进了自噬过程。但是，青葙皂苷是否对心肌梗死具有心肌保护作用尚少有报道。本研究结果显示，青葙皂苷可剂量依赖性降低心肌梗死小鼠的心肌梗死面积，降低心肌梗死小鼠LVESD和LVEDD、升高LVEF和LVFS，降低血清cT-nT、CK-MB和LDH水平，因此青葙皂苷可对心肌梗死具有保护作用，并且对心脏功能具有显著的改善作用。

梗死后组织释放各种趋化因子和细胞因子导致炎性细胞聚集，引起心肌组织纤维化和心脏重塑。早期重塑使心脏发生适应性变化，长期处于这种状态会导致心脏负荷增加，心功能下降，甚至发生心力衰竭[11-12]。调节梗死后的炎性应答反应可以改善心肌梗死后心脏重塑，增强心功能，降低病死率。炎性复合体是固有免疫和炎性反应中的一类重要因子，可通过模式识别受体活化NLRP3/Caspase-1信号通路的蛋白复合体，在机体固有免疫应答系统中发挥重要平台作用。NLRP3炎性小体是一种存在于细胞胞浆中的多蛋白复合物，是目前研究最多、也最为透彻的炎性小体[13]。多项研究表明，NLRP3炎性小体的激活或抑制可影响多种炎性及免疫相关疾病的发生、发展，并且在急性心肌梗死时NLRP3炎性小体的形成和激活也显著增加[14-16]。NLRP3炎性复合体主要由NLRP3、Caspase-1及ASC组成，激活NLRP3/ASC/Caspase-1主要分为两个步骤：首先通过NF-κB参与信号通路介导NLRP3及proIL-1β、proIL-18的合成增加；第二步，NLRP3炎性小体进行组装，催化合成IL-1β及IL-18并分泌至细胞外[17-18]。本研究结果显示，青葙皂苷可呈剂量依赖性抑制心肌梗死小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白表达，而促进IκB α蛋白表达，因此青葙皂苷对NLRP3/Caspase-1信号通路激活的第一步骤具有显著抑制作用。此外，青葙皂苷可呈剂量依赖性降低心肌梗死小鼠血清IL-1β及IL-18水平，说明青葙皂苷对NLRP3/Caspase-1信号通路激活的第二步骤具有显著抑制作用。因此，青葙皂苷对心肌梗死的保护作用可能与其调控NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路有关。

总之，青葙皂苷对心肌梗死具有保护作用，其作用可能与其调控NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路有关。