威柏膏外敷治疗对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织NALP-3炎性体的调控研究∗

李 扬 任开明 左新河 姜 楠

（1.湖北省中医院，湖北 武汉 430061；2.武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060）

世界各地痛风患病率逐年增加，2015年的综述报告显示痛风的患病率升至1%～4%，年发病率约为2.6‰，在西方，男性发病率约为3%～6%，女性约为1%～2%，在毛利族人中甚至高达10%［1］。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，我国痛风的发病率也在上升，其中以台湾地区居民居高，2010年的调查研究显示其患病率为6.24%［2］。高嘌呤饮食、酒精摄入、肥胖是痛风的重要致病因素，痛风常常与2型糖尿病、高血压病、高脂血症以及心脑血管疾病相伴发［3］。

目前临床上控制痛风急性发作的药物主要有秋水仙碱、非甾体抗炎药、糖皮质激素等药物，但这些药物所带来的胃肠道不良反应以及对中枢神经系统、肝脏、造血系统的损害不容忽视，尤其对于老年患者，往往由于存在全身多个器官系统疾病，对这些药物的耐受力更低。本文通信作者任开明教授长期致力于痛风性关节炎的中医中药研究，遵循中医外病外治的思路，根据多年临床经验研制出治疗急性痛风的外敷膏剂——威柏膏（由威灵仙等8味中药组成），通过局部用药直接缓解痛风性关节炎急性发作期症状，减轻炎症反应，以期达到疗效佳、不良反应少的治疗目的。

本课题组前期的研究结果［4］发现，威柏膏能显著减轻大鼠急性痛风性关节炎的炎性反应，下调关节滑膜组织中重要炎性介质白细胞介素-1β（IL-1β）的表达。既往研究表明，IL-1β的成熟和释放依赖于NALP-3炎性体［5-6］，本实验拟进一步研究威柏膏外敷治疗对NALP-3炎性体表达的影响，试图从更深层面来解释威柏膏治疗急性痛风性关节炎的作用机理，为威柏膏临床应用提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只雄性SPF级Wistar大鼠，体质量180～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号SYXK（鄂）2015-0018。SPF动物实验室适应性喂养1周。

1.2 试药与仪器 威柏膏：由威灵仙、黄柏等8味中药制成膏剂，武汉大学人民医院药事部制。秋水仙碱片（西双版纳版纳药业有限公司生产，规格0.5 mg），以1 mg︰100 mL注射用水比例配制成0.01 mg/mL浓度溶液。尿酸钠溶液（25 mg/mL），配制方法同前期研究［4］。尿酸钠晶体参考 Coderre经典法［4，7］配制：194 mL 蒸馏水加6 mL 1 mol/L NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1 mol/L HCL调pH至7.2，搅拌冷却，-4℃冰箱保存24 h，去上清，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，放入研钵内研成细末，用孔径250 μm的金属筛过筛，高温高压灭菌以去除内毒素，装瓶备用。取500 mg尿酸钠晶体加18 mL 0.9%氯化钠注射液，再加2 mL吐温80，加热搅拌，配制成20mL尿酸钠溶液。NALP-3一抗（HPA012878，Sigma）、Caspase-1（BM4291，Boster）一抗，SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。HVE-50型高压消毒锅，Hirayama，USA；HMIAS-2000W高清晰彩色医学图文分析系统，武汉千屏；石蜡组织切片机，Leica Germany；普通光学显微镜、显微照相机，Olympus Japan。

1.3 分组与造模 适应性喂养1周后，32只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、威柏膏组、秋水仙碱组4个组，每组8只。急性痛风性关节炎大鼠模型建立：按Coderre经典方法略做改进，实验动物各组用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，然后消毒踝关节周围皮肤，用1 mL注射针在受试大鼠右侧踝关节背侧45°方向插入胫骨肌腱内侧，正常对照组注入0.25 mL 0.9%氯化钠注射液；模型对照组、威柏膏组、秋水仙碱组均将0.25 mL尿酸钠溶液注入踝关节腔［7］。给药方法：威柏膏组于造模后1 h即开始用威柏膏外敷于受试关节，每日2次；秋水仙碱组用秋水仙碱溶液灌胃，0.15 mg/kg，每日3次。各组给药均为3 d。

1.4 标本采集与检测 造模后步态评分、关节肿胀度测量，方法同前期研究［4］。造模后1 h开始观察大鼠步态，并在24、48、72 h 3个时间点进行评分。步态评分标准如下：0分为正常步态，双足均匀着地；1分为足着地减轻，足趾未展开，轻度跛行；2分为足屈起，趾背着地，明显跛行；3分为足完全离地，三足步态。关节肿胀度=造模后关节周径测量值—造模前关节周径测量值。标本取材、固定、脱钙、切片流程如下：各组大鼠于造模及用药78 h后处死，无菌条件下取各组大鼠受试踝关节上下0.5 cm之间的组织，去掉皮肤，分别放入含有固定液（4%多聚甲醛）的50 mL无菌量杯中，置-4℃冰箱保存24 h。用10%EDTA脱钙10周后石蜡包埋，切成5 μm薄片。关节组织切片HE染色，光镜下观察滑膜病理改变。免疫组化法检测踝关节滑膜组织中NALP-3、Caspase-1的相对表达量。具体步骤为：脱蜡后3%过氧化氢液封闭过氧化物酶，血清封闭，再分别加抗大鼠NALP-3、Caspase-1的一抗，按SABC试剂盒标准步骤操作，最后经DAB溶液显色。阴性对照除了用PBS代替一抗外，所有步骤相同，以有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。每张玻片随机选择20个视野（×200），用HMIAS-2000千屏高清彩色医学图文分析系统进行吸光度测量并自动转换为A（吸光度）值，每个标本的NALP-3、Caspase-1相对表达含量用20个视野的平均A值表示。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠步态观察结果比较 见表1。造模后1 h，各组大鼠步态均不正常：正常对照组大鼠轻度跛行；其余3组大鼠足屈起，趾背着地，明显跛行或呈三足步态。造模24 h后可见：正常对照组大鼠步态恢复正常，其余3组大鼠仍明显跛行。随时间推移，与模型对照组比较，威柏膏组及秋水仙碱组评分差异有统计学意义（P＜0.05）。威柏膏组较秋水仙碱组恢复快（P＜0.05）。

表1 各组大鼠步态评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠步态评分比较（分，±s）

与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与秋水仙碱组比较，▲P＜0.05。下同

组别n 1 h 24 h 48 h 72 h正常对照组模型对照组威柏膏组秋水仙碱组8 8 8 80.625±0.1712.250±0.233*1.875±0.117△1.875±0.211△02.875±0.117*2.250±0.153△2.375±0.238△02.250±0.153*1.500±0.177△▲1.875±0.113△02.000±0.005*1.375±0.171△▲1.625±0.246△

2.2 各组大鼠关节肿胀度动态测量结果比较 见表2。造模后1 h，各组大鼠踝关节处均肿胀，正常对照组大鼠轻度红肿，模型对照组、威柏膏组、秋水仙碱组踝关节处均明显红肿。造模24 h后观察可见：正常对照组大鼠关节外观恢复正常，模型对照组、威柏膏组、秋水仙碱组大鼠踝关节仍然严重红肿。随时间推移，与模型对照组比较，威柏膏组及秋水仙碱组，肿胀度下降明显（P＜0.05）。威柏膏组较秋水仙碱组下降更明显（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠滑膜病理观察结果 见图1。正常对照组大鼠关节滑膜组织偶见炎性细胞浸润，滑膜组织厚度正常，未见增生。模型对照组大鼠滑膜组织可见大量中性粒细胞、巨噬细胞浸润，毛细血管扩张、充血。与模型对照组比较，威柏膏组炎性细胞浸润明显减少。

表2 各组大鼠关节肿胀度比较（cm，±s）

表2 各组大鼠关节肿胀度比较（cm，±s）

组别正常对照组模型对照组威柏膏组秋水仙碱组n 8 8 8 81 h 0.28±0.0410.73±0.104*0.62±0.089△0.65±0.094△24 h 0.17±0.0250.78±0.111*0.71±0.101△0.72±0.103△48 h 0.14±0.0200.65±0.092*0.29±0.042△▲0.44±0.063△72 h 0.06±0.0120.61±0.087*0.11±0.015△▲0.28±0.040△

图1 各组大鼠滑膜组织观察（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠关节滑膜组织中NALP-3、Caspase-1相对表达含量比较 见图2～图3，表3。与正常对照组比较，模型对照组踝关节滑膜组织中NALP-3、Caspase-1相对表达含量明显增加（P＜0.05）；与模型对照组比较，威柏膏组、秋水仙碱组滑膜组织中NALP-3、Caspase-1相对表达含量显著减低（P＜0.05），威柏膏组与秋水仙碱组之间无明显差异（P＞0.05）。

图2 各组大鼠踝关节滑膜组织NALP-3的表达（免疫组化染色，200倍）

图3 各组大鼠踝关节滑膜组织Caspase-1的表达（免疫组化染色，200倍）

表3 各组大鼠关节滑膜组织NALP-3、Caspase-1相对表达含量（±s）

表3 各组大鼠关节滑膜组织NALP-3、Caspase-1相对表达含量（±s）

组别正常对照组模型对照组威柏膏组秋水仙碱组n8888 NALP-30.1323±0.01650.2012±0.0245*0.1751±0.0218△0.1685±0.0175△Caspase-10.1389±0.01950.2162±0.0285*0.1652±0.0163△0.1725±0.0115△

3 讨 论

中医理论认为痛风发生的主要原因在于先天禀赋不足、脾肾功能失调，湿热之邪痹阻于肢体、经络，气血运行失畅所致，与遗传、体质、饮食、外感、环境等因素有关。急性痛风性关节炎多表现为风湿热痹，治法以清热除湿、通络止痛为主。据中药典籍《唐本草》《海上集验方》《药品化义》《广西中草药》等记载，威灵仙具有祛风湿、通经络、止痹痛、消骨鲠等功效。本文通信作者任开明教授课题组多年来以威灵仙为核心，研究其对痛风性肾病、痛风性关节炎的作用，实验研究已经发现威灵仙能显著减少尿酸性肾病模型大鼠尿酸盐结晶在肾小管间质的沉积，从而保护肾小管间质［8］，抑制了肾小管和肾间质的上皮细胞表型转化及下调NF-κB的表达［9］。在临床研究中同样证实威灵仙、草决明复方胶囊能降低血尿酸及血脂、改善肾功能、减少蛋白尿［10］。在此基础上，任开明教授遵循中医外病外治的治则，根据多年临床经验研制出治疗急性痛风性关节炎的外敷膏剂——威柏膏，此方由威灵仙配伍黄柏、苍术、乳香、没药等8味中药而成，其中威灵仙祛风除湿、促进尿酸溶解；黄柏、苍术燥湿清热；乳香、没药、当归活血调气止痛；五加皮祛风湿、利筋骨；冰片促进透皮吸收，引药直达痛风炎症部位，全方共奏清热祛湿、活血止痛之功效。本课题组前期的动物实验研究［4］发现，该方能显著减轻急性痛风性关节炎模型大鼠的关节肿胀度，减少滑膜组织炎性细胞浸润，并能显著降低受试关节滑膜组织中IL-1β的表达。

急性痛风性关节炎是由于嘌呤代谢紊乱使血尿酸水平升高，尿酸钠盐结晶沉积于关节腔内，引起白细胞趋化、吞噬，从而形成了关节红肿热痛的急性炎症反应［11］。IL-1β是介导痛风性关节炎的重要炎症因子，在中性粒细胞趋化、激活过程中起重要作用［12-13］。Martinon等［5-6］研究提示IL-1β的成熟和释放依赖于NALP-3炎性体（NACHT-LRR-PYD结构域蛋白3），NALP-3炎性体介导了急性痛风的发生发展过程。NALP-3炎性体是一类分子量约为700 kDa的大分子蛋白复合体，在细胞质内发挥外源性微生物或内源性信号感受器的作用，是活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）的分子平台，直接调控着IL-1β、IL-18、IL-33等促炎细胞因子的成熟和分泌，在天然免疫、获得性免疫反应中发挥重要作用［14-15］。NALP-3炎性体主要由3个部分组成：核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）家族成员NALP-3、衔接蛋白ASC，以及效应蛋白Caspase-1［16］。NALP-3是其中的核心蛋白，功能是将下游的衔接蛋白ASC和效应分子Caspase-1前体（Pro-caspase-1）连接起来。NALP-3炎性体完成组装后，使Pro-caspase-1自动催化成Caspase-1，后者又称IL-1β转化酶，进一步将无活性IL-1β前体剪切为成熟的IL-1β［17］。

根据上述机理，在前期研究基础上，本实验进一步研究了威柏膏对急性痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜中NALP-3炎性体的调控作用，实验结果发现威柏膏可以显著降低滑膜组织中NALP-3炎性体的核心蛋白NALP-3及效应分子Caspase-1的表达含量，从而有效减少其下游IL-1β前体向成熟IL-1β的转化，最终减轻关节滑膜炎症反应，提示威柏膏对急性痛风关节滑膜中NALP-3/Caspase-1/IL-1β通路的调控是其治疗作用的核心环节。本实验结果为威柏膏的临床应用提供了较为有力的分子机制依据。

现有的治疗痛风急性发作的常用药物为秋水仙碱，但其毒副作用十分明显；常用外用药主要为非甾体抗炎药，如扶他林等，可以缓解轻、中度疼痛，但无法解决痛风发作的根本问题，还有抑制软骨的合成的不良反应，并能破坏软骨细胞［18］。本实验中对急性痛风模型大鼠步态与关节肿胀度的观察发现，威柏膏对急性痛风性关节炎止痛效果优于秋水仙碱组，充分说明中药外治法治疗急性痛风性关节炎的优势，威柏膏可以从病因层面调节痛风受累关节滑膜组织的炎性反应，其方法简单易行，便于患者使用，并可避免口服药物的诸多不良反应，因此拥有广阔的临床应用前景。