针刺对膝骨性关节炎大鼠NGF、SP的影响∗

缪辉宇 曲崇正 黄宏兴

（广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510407）

针刺疗法在治疗膝关节骨性关节炎（KOA），尤其是在镇痛方面的确切疗效已被临床实践所验证。以往的研究较多局限于针刺疗法对关节软骨的病变及炎性因子的刺激上，但对针刺镇痛的临床研究并不多见。因此，本实验通过建立KOA动物模型，以大鼠膝关节滑膜为研究对象，引入神经生长因子（NGF）和P物质（SP），采用免疫组化技术研究针刺对NGF、SP的影响，为针刺治疗KOA的镇痛机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年SD大鼠75只，体质量220～280 g，雌性40只，雄性35只，来源于广州中医药大学动物实验中心。所有大鼠均饲养于恒温恒湿的清洁环境中，环境温度为（25±1）℃，湿度70%，每天12 h光照/12 h黑暗，所选大鼠在实验室喂养并适应饲养1周，实验期间动物的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 试药与仪器 1）试药：木瓜蛋白酶（广西南宁杰沃利生物制品有限公司生产），配制成0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理盐水。即用型兔抗人NGF及SP、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司生产）。西乐葆（辉瑞制药有限公司生产，国药准字J20140072，0.2 g）。戊巴比妥钠（成都华夏公司生产，批号922L0314，50 mg）。2）仪器：揿针（北京中研太和医疗器械有限公司生产；长度为5 mm、直径为0.28 mm，苏食药监械生产许20010168号）。

1.3 分组与造模 采用随机数字表将大鼠分为5组，各15只，其中4组进行木瓜蛋白酶造模，另1组不做任何干预作为对照的正常组，造模方法为：将大鼠用戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行静脉注射麻醉，对左侧膝关节皮肤进行常规消毒，然后在麻醉起效后将0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理盐水经大鼠的髌上韧带两侧注入至左膝关节腔内，每3日注射1次，连续注射3次完成造模。造模术后持续1周肌注青霉素5万U/d以预防感染。造模大鼠分为造模组、西乐葆组、针刺穴位组、针刺非穴组。

1.4 干预方法 动物常规饲养，干预方法在木瓜蛋白酶末次注入后2周后进行。1）造模组和正常组：正常饲养不做其他处理。2）针刺穴位组：取穴参照华兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》［1］中大鼠穴位定位，取左侧膝眼、血海、阳陵泉穴。操作方法：常规消毒局部皮肤，左手固定大鼠左膝部，右手用镊子夹住针柄，针尖在穴位垂直穿刺，然后用胶带固定针柄30 min，每日1次。所有大鼠在7 d后都被处死。处死后取下滑膜。3）针刺非穴组：选择穴位组选择的3个穴位旁开2 cm的非穴位进行针灸，其余操作均同穴位组。4）西乐葆组：按24 mg/kg溶于2 mL纯净水中灌胃，每日1次，连续7 d后处死全部大鼠。

1.5 标本采集及检测 造模组和正常组在造模结束两周后以空气栓塞法处死造模组和正常组的大鼠，无菌条件下取大鼠左膝内下方滑膜，0.9%氯化钠注射液冲洗后用10%的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，备用。针刺穴位组、针刺非穴位组、西乐葆组均在干预7 d后处死大鼠并取大鼠膝关节滑膜。具体处死方法和取材同造模组及正常组。1）免疫组化染色：将石蜡包埋好的滑膜标本切片，厚约4 μm，分别进行NGF和SP免疫组化染色。常规脱蜡至水后，于0.3%H2O2的甲醇内进行室温孵育20 min，再在92℃～98℃的医用微波下抗原修复10 min。一抗：正常山羊血清密封剂在室温下孵育20 min，用适当稀释的抗NGF或SP滴注（一部分切片滴NGF抗体，剩下一部分滴SP抗体），湿盒内4℃恒温过夜。二抗：PBS溶液冲洗3次，每次间隔5 min，生物素化二抗，滴加SABC试剂后37℃孵育20 min。DAB显色液显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。2）免疫组化观察及等级标准：用显微镜观察各组阳性细胞形态及分布，进行真彩色图像分析（德国Koutron公司IBAS真彩色图像分析仪）。根据阳性血管分布占比分为3级：＜40%为-，40%～70%为+，＞70%为++。每张病理切片选择3个视野进行分析，分别记录阳性表达的数量，阳性表达数取切片3个观察视野的平均值。根据图像分析系统，算出阳性面积和阳性区域平均灰度值，折算成阳性单位值（PU），并按文献［2］方法PU=［（区域阳性产物灰度值-区域灰度值）/（区域背景面积密度×最大灰度分级）］×100%。PU大小与反应强度成正比。

1.6 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件。计量资料以（±s），组间比较用t检验，计数资料用（%），组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组滑膜切片NGF表达 见图1。NGF在血管周围表达，为胞浆着色，棕黄色，呈半环形或环形，颗粒状。阳性细胞染色＞血管周长的40%即代表阳性结果。每张病理切片选择3个视野进行分析，分别记录阳性表达的数量，阳性表达数取切片3个观察视野的平均值。正常组见少量NGF阳性细胞；造模组较正常组明显增多；西乐葆组、针刺非穴组与针刺穴位组阳性细胞数较造模组降低；但西乐葆组、针刺非穴组降低幅度更大。

图1 滑膜切片NGF表达（免疫组化法，400倍）

2.2 各组滑膜切片SP表达 见图2。SP位于血管壁，呈棕黄色颗粒状。阳性细胞染色＞血管周长的40%即代表阳性结果。每张切片同样选择3个视野进行分析，阳性表达数取3个记录的均值。正常组见少量SP阳性细胞；造模组较正常组明显增多；西乐葆组、针刺非穴组与针刺穴位组阳性细胞数较造模组降低；但西乐葆组、针刺非穴组降低幅度更大。

图2 滑膜切片SP表达（免疫组化法，400倍）

2.3 各组大鼠NGF阴性、阳性、强阳性表达情况 见表1。针刺穴位组NGF总阳性率为13.33%，明显低于非针刺穴位组60.00%（P＜0.01）；而西乐葆组与针刺穴位组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠NGF阴性、阳性、强阳性表达情况（n）

2.4 各组大鼠SP阴性、阳性、强阳性表达情况 见表2。针刺穴位组SP总阳性率为6.67%，显著低于针刺非穴组的SP总阳性率53.33%（P＜0.01）；但针刺穴位组与西乐葆组比较差异不显著（P＞0.05）。

表2 各组大鼠SP阴性、阳性、强阳性表达情况（n）

2.5 各组大鼠NGF、SP水平比较 见表3。较之造模组大鼠，针刺穴位组、西乐葆组大鼠的NGF、SP阳性表达率明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；且针刺穴位组的NGF、SP阳性表达低于针刺非穴组（P＜0.05）；但针刺穴位组与西乐葆组比较NGF、SP阳性表达并无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠滑膜内NGF、SP表达比较（Pu，±s）

表3 各组大鼠滑膜内NGF、SP表达比较（Pu，±s）

组别正常组造模组西乐葆组针刺穴位组针刺非穴组n 1515151515 NGF-0.41±2.3127.39±20.771）2.17±2.861.81±2.742）11.23±10.21 SP-0.33±2.3729.29±13.16*2.61±2.18*1.75±1.99*△10.53±9.88

3 讨论

骨关节炎属中医学“骨痹”范畴，多因人体正气亏虚，风寒湿外邪侵袭，痹阻气血，流注经脉所致［3］。65岁以上老年人KOA发病率高达85%［4-5］。现有西医治疗多以非甾体消炎药缓解症状为主，但长期使用后胃肠道毒副作用明显，常使患者不能耐受而终止治疗。目前临床上已越来越多地使用针刺来达到镇痛的效果，且针刺副作用小，患者能够长期治疗。

NGF是神经营养因子中的一员，主要起着维持神经元存活，调节周围和中枢神经元发育的作用，是人体中不可缺少的因子。有研究报道，神经生长因子主要是根据低亲和力p75神经营养因子受体（p75ntr）和高亲和力酪氨酸激酶A（trka）调控疼痛，在疼痛的发生和发展中起着生物学作用，参与疼痛发生、发展的各个环节［6］。本实验发现，NGF水平升高与疼痛呈正相关［7］。而针刺镇痛与NGF相关研究鲜见发表，仅有熊键等发现电针可以通过抑制NGF的表达达到镇痛的目的［8］。

SP是调节机体免疫和内分泌的重要因素，可被免疫系统和神经系统识别［9-10］。在机体不同系统具有不同的生理学效应，对针灸与P物质的研究主要在镇痛作用方面。徐小丹［11］研究显示电针可抑制SP的释放，从而产生明显的镇痛作用。郭奎奎等发现局部和远道取穴在抑制SP释放及镇痛方面无显著性差异［12］。刘苗苗等发现针刺联合中药离子可缓解腰椎间盘突出症引起的疼痛［13］。

针刺疗法在治疗KOA方面特别是镇痛效果的确切疗效已被临床实践所验证。以往的研究较多局限于关节软骨的病变及炎性因子的刺激上。本课题通过建立KOA大鼠模型，以大鼠膝关节滑膜为研究对象，引入NGF和SP细胞因子，采用免疫组化技术研究针刺对NGF、SP的影响，为针刺治疗KOA的镇痛机制提供了实验依据。本研究结果显示，针刺穴位组与西乐葆组NGF、SP含量均显著低于造模组，且两者对比无显著性差异（P＞0.05），两组在缓解疼痛方面疗效相当，但针灸更加安全可靠，在今后KOA患者的长期治疗中更可取。

目前临床上治疗KOA主要是口服西乐葆，由于老年人患KOA较多，且易合并心血管、胃肠道等其他疾病，但西乐葆临床适用性有限。且既往有临床研究表明，西乐葆治疗老年KOA易引起恶心、胀气、便秘等不良反应。而针灸疗法可疏通经络、调和阴阳、扶正去邪，具有许多优点：1）适应证广，可用于多科疾病；2）操作方法简便易行；3）医疗费用经济；4）副作用较小。阳陵泉、血海、膝眼是临床上治疗KOA常用穴位［14-15］。针刺上述穴位可降低疼痛中枢的敏感性，改善关节疼痛症状以及局部组织微循环和全身血液循环，加速关节积液和血肿的吸收，缓解关节肿胀症状，增强机体对外界刺激的承受能力［16］。

综上所述，针刺能有效抑制KOA大鼠滑膜内NGF、SP的表达，这可能是针刺治疗KOA有效的机制之一，但由于本研究数据较小，其具体作用机制以及滑膜是否有修复作用，还有待进一步研究。