人脐带间充质干细胞对早发性卵巢功能不全大鼠的影响

庄亚琼　杨晴晴　段畅　张林东　封全灵

【摘要】 目的：探討人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）对早发性卵巢功能不全模型大鼠卵巢功能的影响。方法：将正常动情周期的36只雌性ICR小鼠按随机数字表法分为移植组（n=12）、模型对照组（n=12）与空白对照组（n=12）。空白对照组大鼠不进行任何处理，模型对照组和移植组大鼠腹腔注射顺铂（CDDP）建立早发性卵巢功能不全（POI）模型。移植组通过尾静脉注射hUCMSCs进行治疗，模型对照组与空白对照组均注射等量灭菌用水。移植后2周，观察三组一般情况，HE染色三组的切片中各阶段的卵泡情况，同时观察卵巢结构变化。测定血清中雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）水平，并分析卵巢储备功能的变化。结果：电镜下显示，模型对照组颗粒细胞核溶解、核膜消失、线粒体空泡化，线粒体与内质网数量逐渐减少。移植组颗粒细胞细胞核膜逐渐修复，核仁出现，内质网与线粒体少量存在。造模后3 d，模型对照组E2含量低于空白对照组，FSH含量高于空白对照组（P<0.05）。移植后2周，移植组AMH含量高于模型对照组（P<0.05），三组AMH比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：hUCMSCs移植对POI大鼠的卵巢结构和功能具有一定的修复作用。

【关键词】 间充质干细胞; 早发性卵巢功能不全; 顺铂

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on Rats with Premature Ovarian Insufficiency/ZHUANG Yaqiong，YANG Qingqing，DUAN Chang，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（23）：0-018

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUCMSCs）on ovarian function in rats with early-onset ovarian dysfunction.Method：36 female ICR mice with normal estrous cycle were divided into transplantation group（n=12），model control group（n=12）and blank control group（n=12）according to random number table method.The blank control group without any treatment.The model control group and transplantation group rats were intraperitoneally injected with cisplatin（CDDP）to establish premature ovarian insufficiency（POI）model.The transplantation group was treated with intravenous injection of hUCMSCs.The model control group and blank control group were injected with the same amount of sterilizing water.2 weeks after transplantation，the general conditions of the three groups were observed，and the follicular conditions at each stage in the sections of the three groups with HE staining were observed，and the structural changes of the ovary were observed at the same time.The levels of estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH），luteinizing hormone（LH）and anti-Mullerian hormone（AMH）in serum were measured，and the changes of ovarian reserve function were analyzed.Result：Electron microscopy showed that the number of mitochondria and endoplasmic reticulum decreased gradually in the model control group，while the number of nuclear membrane repaired gradually，nucleolus appeared，and endoplasmic reticulum and mitochondria existed little in the transplantation group.3 days after modeling，E2 content in the model control group was lower than that in the blank control group，and FSH content was higher than that in the blank control group（P<0.05）.At 2 weeks after transplantation，AMH content in the transplantation group was higher than that in the model control group（P<0.05）.AMH in the three groups were compared，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：hUCMSCs transplantation can repair the ovarian structure and function of POI rats.

【Key words】 Mesenchymal stem cells; Premature ovarian insufficiency; CDDP

First-authors address：Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.23.004

早发性卵巢功能不全（POI）指女性在40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征，以月经紊乱（如停经或稀发月经）伴有高促性腺激素和低雌激素为特征。停经或月经稀发4个月，间隔>4周连续两次，FSH>25 U/L[1]。POI主要引起雌激素缺乏症状，进一步发展会导致卵巢早衰（POF）生育能力下降，目前POI治疗方式有HRT激素治疗和免疫治疗等方法恢复卵巢功能，但是这些治疗效果不能促进自身卵巢组织再生修复[2]。近年来，国内外试图应用脐带间充质干细胞治疗卵巢早衰，利用动物模型进行了探索，为早发性卵巢功能不全（卵巢早衰）患者的治疗提供了可能的新希望。在化疗药物的应用过程中发现有些患者在使用化疗药物后出现了如持续闭经和潮热、多汗等低雌激素表现，内分泌检查结果提示卵巢功能减退并引起患者的不孕。本研究应用人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）治疗由顺铂（CDDP）引起的卵巢早衰大鼠，观察卵巢结构及激素水平变化，为指导临床提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）hUCMSCs的分离、培养与鉴定。选取2018年12月于郑州大学第三附属医院足月分娩产妇胎儿的脐带样本。产妇产前1个月内均行母血检测，无各种传染疾病的健康孕妇。收集前所有患者及家属均知情同意，并签署知情同意书，本研究经过郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，在严格无菌的条件下提取正常分娩的足月健康新生儿的脐带和胎盘，将脐带剔除动静脉血管，分离出的脐带切割成1～2 mm的小块，采用贴壁法进行原代细胞培养，贴壁细胞保存备用。在合适的培养基和环境下对hUCMSCs五代细胞株进行复苏、培养擴增、传代和保存。采用流式细胞仪鉴定，选择生长良好的第5代的hUCMSCs，用1 mL注射器将1 mL细胞悬液注入移植组小鼠的尾静脉中。（2）实验动物和试剂：阴道涂片提示有正常的发情周期的ICR雌性大鼠36只，体重（200±12）g，购自动物中心。将36只雌性大鼠按随机数字表法分为空白对照组

12只，模型对照组12只，移植组12只。CDDP购自武汉博士德公司;检测血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）浓度的ELISA 试剂盒购自北京金桥生物。

1.2 方法 POI模型大鼠建立模型：对照组和移植组腹腔注射CDDP溶液，第1天注射 50 mg/kg，第2天连续注射16 mg/kg。空白对照组注射等体积灭菌用水。模型对照组造模后无额外处理，观察记录大鼠一般情况，造模前及造模后3 d尾静脉采血，检测FSH、E2含量。移植组在造模完成后尾静脉注射1×106/mL的hUCMSCs单细胞悬液1 mL。模型对照组与空白对照组均注射等量灭菌用水。

1.3 观察指标 造模后3 d，利用生化方法测定并比较空白对照组与模型对照组雌激素（E2）与抗苗勒管激素（AMH）的水平。移植后2周，利用生化方法测定并比较三组卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）及AMH水平，HE染色电镜下观察CDDP标本及空白对照组的切片中各阶段的卵泡情况，同时观察卵巢结构变化。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组卵巢结构 hUCMSCs移植后2周，空白对照组颗粒细胞的细胞面膜完整、细胞无水肿，线粒体分布均匀、清晰可见，细胞核内染色质均匀，内质网清晰可见，无扩张现象，属正常颗粒细胞形态。模型对照组颗粒细胞的细胞核溶解，核膜消失，染色质固缩、边聚，有凋亡小体出现，线粒体空泡化，线粒体、内质网、溶酶体等细胞器数减少，移植组颗粒细胞核膜逐渐修复，核仁出现，内质网与线粒体少量存在。见图1。

2.2 三组卵巢大体观 空白对照组大鼠卵巢外观无异常，造模后大鼠卵巢比空白对照组明显缩小，卵巢表面的颗粒样隆起明显减少，卵巢可见局部有充血现象。模型对照组和移植组卵巢外观相比差异不明显。

2.3 三组各阶段卵泡计数比较 三组始基卵泡、初级卵泡、窦卵泡和次级卵泡个数比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.4 造模后3 d空白对照组与模型对照组E2、FSH水平 模型对照组E2含量低于空白对照组，模型对照组FSH含量高于空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.5 三组卵巢储备功能变化 移植后2周，三组FSH/LH水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05），移植组AMH含量高于模型对照组，差异有统计学意义（P<0.05），三组AMH比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

近些年来，间充质干细胞广泛应用于临床各种疾病的治疗研究，其类型主要有脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞应用于临床的年份较长，应用过程中出现了各种不足，骨髓间充质干细胞需要对患者进行骨髓穿刺，引起患者的疼痛不适，甚至得不到患者的配合，且骨髓间充质干细胞随着供体年龄的增长分化能力和细胞数量均不能达到理想的效果，无论自体移植还是异体移植均有可能造成感染[3-4]。这些问题使骨髓间充质干细胞的应用大大受到了限制。而脐带间充质干细胞的生长环境更易实现，脐带间充质干细胞具有更强的增殖分化能力与低免疫原性，而且细胞来源相对安全提取和培养更加方便，不会给患者带来额外的痛苦，也不易造成疾病在人群间的传播[5-7]。基于脐带间充质干细胞的这些优点，其未来在临床可能拥有更好的发展前景，可能成为治疗疾病的一种干细胞类型，在临床上推广更具有优势[8]。

间充质干细胞治疗在动物实验和临床研究领域获得了很大的进展，部分研究成果已开始在恶性肿瘤、自身免疫系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病等多种临床试验中得到应用。其中hUCMSCs在狼疮性肾炎、类风湿关节炎、糖尿病、神经障碍性疾、失代偿期肝硬化、肝衰竭等疾病的临床治疗研究中取得的成果，提示干细胞移植治疗有可能是未来卵巢早衰治疗的一个方向[9-11]。

顺铂是一种常用的化疗药物，有研究表明其在杀死肿瘤细胞的同时也可对正常细胞造成不同程度的伤害，顺铂化疗过程中引发卵巢功能低下的报道逐年增加[12-14]。本研究通过顺铂作用于大鼠建立早发卵巢功能不全模型，结果得出：造模后3 d，模型对照组E2含量低于空白对照组（P<0.05），FSH含量高于空白对照组（P<0.05），提示造模成功。之后对CDDP建立的早发卵巢功能不全的大鼠模型进行尾静脉注射治疗，移植后2周，移植组AMH含量高于模型对照组（P<0.05），提示移植组的大鼠卵巢功能得到了有效的改善，人脐带间充质干细胞能够在CDDP建立的早发卵巢功能不全的大鼠体内存活和转移，并且能够对大鼠血清中的FSH、E2、AMH、LH这些激素水平产生影响，镜下观卵巢结构中颗粒细胞核膜逐渐修复，核仁出现，内质网与线粒体少量存在，可见脐带间充质干细胞可以促进卵巢颗粒细胞的再生。

本研究为期待间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全的治疗提供了理论依据，初步探讨静脉注射方法的可行性，为脐带间充质干细胞在临床和基础研究领域提供了一些新的思路，为临床上治疗早发性卵巢功能不全提供新的方法。为化疗药物导致的POI的治疗提供新的临床借鉴研究。近年来POI的发病率呈上升趋势。POI不但导致年轻女性闭经、继发性不孕、低雌激素等临床症状，且对患者神经系统、心脑血管、内分泌、骨骼等全身多器官构成影响，严重影响患者的身心健康[15-20]。但是POI还没有非常有效的治疗方法，因此针对POI的相关研究将为该疾病的治疗具有重要的应用价值。

综上所述，人脐带间充质干细胞可以在大鼠体内存活并改善顺铂造模所致卵巢早发功能不全，可以在一定程度上修复卵巢的内分泌功能。但是人脐带间充质干细胞能否在人体内存活和发挥作用以及其发挥作用的具体机制仍需免疫学及移植试验进一步研究验证。

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（收稿日期：2019-04-15） （本文編辑：田婧）