紫杉醇联合顺铂对甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移的影响

陈娟 李元梅 成伯宁

[摘要] 目的 探討紫杉醇联合顺铂对甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移的影响。 方法 在DMEM培养液（含15%胎牛血清）中加入细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养，到80%左右融合后分为试验组、空白对照组（只含DMEM培养基），试验组又分为3 μmol/L紫杉醇组（紫杉醇组）、30 μmol/L顺铂组（顺铂组）、3 μmol/L紫杉醇+30 μmol/L顺铂联合用药组（联合用药组），MTT法检测细胞相对活力，流式细胞数检测细胞周期，细胞迁移试验，细胞侵袭试验，Western blot法检测相关蛋白表达，然后统计分析各组细胞活力、细胞周期、细胞迁移、侵袭能力、AKT信号通路、细胞周期相关蛋白、细胞MMP表达。 结果 联合用药组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），细胞周期G1显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05）。顺铂组、紫杉醇组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于空白对照组（P<0.05），细胞周期G1均显著高于空白对照组（P<0.05）。联合用药组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05）。顺铂组、紫杉醇组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于空白对照组（P<0.05）。结论 紫杉醇联合顺铂能够显著抑制甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移。

[关键词] 紫杉醇;顺铂;甲状腺癌;SW579;增殖;迁移

[中图分类号] R581          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）20-0043-05

Effect of paclitaxel combined with cisplatin on proliferation and migration of thyroid carcinoma cell line SW579

CHEN Juan LI Yuanmei CHENG Boning

Department of Endocrinology，Xixi Hospital of Hangzhou City，Hangzhou 310023，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of paclitaxel combined with cisplatin on the proliferation and migration of thyroid carcinoma cell line SW579. Methods Cells were added to DMEM medium（containing 15% fetal bovine serum）， cultured in a 37℃， 5% CO2 incubator， and divided into test group and blank control group （only DMEM medium） after about 80% confluence. The test group was further divided into 3 μmol/L paclitaxel group（paclitaxel group）， 30 μmol/L cisplatin group（cisplatin group）， 3 μmol/L paclitaxel+30 μmol/L cisplatin combination group（combination group）， The relative viability of the cells was detected by MTT method. The cell cycle， the cell migration assay and the cell invasion assay were detected by flow cytometry. The expression of related proteins were detected by Western blot. And then the cell viability， cell cycle， cell migration， invasion ability， AKT signaling pathway， cell cycle related protein and cell MMP expression were statistically analyzed. Results The cell viability， cell cycle S， G2， cell migration and cell invasion ability of the combination group were significantly lower than those of the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group （P<0.05）. The cell cycle G1 in the combination group was significantly higher than that of the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group（P<0.05）. The cell viability， cell cycle S， G2， cell migration and cell invasion ability of cisplatin group and paclitaxel group were significantly lower than the blank control group（P<0.05）， and the cell cycle G1 of cisplatin group and paclitaxel group was significantly higher than that of the blank control group（P<0.05）. The expressions of PTEN/GADPH and P27/GADPH in the combination group were significantly higher than those in the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group（P<0.05）. The expressions of P-AKT/AKT， CyclinD1/GADPH， MMP-2/GADPH， MMP-9/GADPH in the combination group were significantly lower than those in cisplatin group， paclitaxel group and blank control group（P<0.05）. The expressions of PTEN/GADPH and P27/GADPH in cisplatin group and paclitaxel group were significantly higher than those in blank control group（P<0.05）. The expressions of AKT/AKT， CyclinD1/GADPH， MMP-2/GADPH and MMP-9/GADPH in the cisplatin group and paclitaxel group were significantly lower than the blank control group（P<0.05）. Conclusion Paclitaxel combined with cisplatin can significantly inhibit the proliferation and migration of thyroid cancer cell line SW579.

[Key words] Paclitaxel; Cisplatin;Thyroid cancer;SW579;Proliferation;Migration

甲状腺癌属于一种内分泌系统恶性肿瘤，在临床极为常见，主要为甲状腺滤泡状癌、乳头状癌，占甲状腺癌的90%左右[1]。同时，近年来，其发病率日益提升[2]。現阶段，手术+放疗仍然是临床治疗甲状腺癌过程中通常采用的方法，获取了一定的临床疗效。因此，相关学者认为[3]，在甲状腺癌的治疗中，紫杉醇联合顺铂也能够促进临床疗效的提升。紫杉醇、顺铂均属于肿瘤化疗药物，在临床极为常用，目前在甲状腺癌的治疗过程中得到了较为广泛的应用，其能够抑制肿瘤细胞的有丝分裂，促进肿瘤细胞坏死，从而发挥治疗作用[4]。在甲状腺癌等多种肿瘤中，蛋白激酶B（AKT）信号通路异常激活，是多种化疗药物的作用靶点，直接而深刻地影响着肿瘤的发生发展[5]。相关医学研究表明[6-14]，紫杉醇联合顺铂能够在极大程度上促进卵巢癌、宫颈癌治疗效果的提升，同时，通过AKT信号通路途径，紫杉醇、顺铂均能够发挥抗癌作用。本研究探讨了紫杉醇联合顺铂对甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器  采用日本Nikon公司生产的Eclipse TS100倒置光学显微镜，美国Thermo Scientific公司生产的Forma Class II生物安全柜，美国Bio-Rad公司生产的ChemiDocTM XRS凝胶成像系统，美国Eppendorf公司生产的5417R离心机。

1.1.2 药品及试剂  应用中国食品药品检定研究所提供的紫杉醇（批号：10382-201102，纯度：99.6%）、顺铂（批号：100401-201302，纯度：99.8%），美国Sigma公司生产的MTT，江苏南通碧云天生物技术研究所提供的细胞周期检测试剂盒、山羊抗兔IgG（H+L，辣根过氧化物酶标记）、山羊抗小鼠IgG（H+L，辣根过氧化物酶标记）、兔抗GADPH单克隆抗体、二辛可酸（BCA）蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液，美国Epitmics公司生产的AKT、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体、磷酸酶及张力蛋白同源基因（兔抗人第10号染色体缺失，PTEN），美国CST公司生产的基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9单克隆抗体、p27、兔抗细胞周期蛋白D1（Cyclin D1），美国Corning公司生产的Transwell小室，美国Gibco公司生产的胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清。

1.1.3 细胞  运用中国科学院上海细胞库提供的甲状腺癌细胞SW579。

1.2 方法

1.2.1 分组和给药  在DMEM培养液（含15%胎牛血清）中加入细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养，到80%左右融合后分为试验组、空白对照组（只含DMEM培养基），试验组又分为3 μmol/L紫杉醇组（紫杉醇组）、30 μmol/L顺铂组（顺铂组）、3 μmol/L紫杉醇+30 μmol/L顺铂联合用药组（联合用药组）。

1.2.2 MTT法检测细胞相对活力  对细胞进行消化，在此过程中充分利用2.5%胰酶溶液，将细胞密度调整到4×103/mL，在96孔板上接种，每孔200 μL，在37℃、5%CO2培养箱中培养1 d，给药后在37℃、5%CO2培养箱中继续培养2 d，加入20 μL 5 mg/mL MTT，培养4 h后弃上清，加入150 μL二甲基亚砜，待充分溶解结晶后，在波长570 nm处测定光密度（OD570值），按试验组与空白对照组OD570之比的方法，计算细胞相对活力。

1.2.3 流式细胞数检测细胞周期  用2.5%胰酶溶液对细胞进行消化，将细胞密度调整为8×103/mL，在6孔板中接种，每孔1 mL，在37℃、5%CO2培养箱中培养1 d，给药后在37℃、5%CO2培养箱中继续培养2 d，然后收集细胞，用75%乙醇将其固定，在4℃温度下放置2 d。离心10 min，速率为3000 r/min，离心半径为15 cm，弃去乙醇，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入5 μL 10 mg/mL核糖核酸酶（RNAse），放置在37℃培养箱中，培养1 h，再加入100 μg/mL碘化丙啶（PI）染液，室温下进行避光染色30 min。采用流式细胞仪检测DNA含量，采用FACSort Cell Quest软件分析细胞周期并检测细胞凋亡，之后进行DNA分析。

1.2.4  细胞迁移试验  培养和收集细胞方法同上。然后在Transwell小室的上室加入细胞消化，将DMEM培养液（含5%胎牛血清）应用于下室，继续培养1 d。取出Transwell小室，分别应用PBS、多聚甲醛、结晶紫洗涤、固定、染色。在100倍倒置光学显微镜下，随机选出5个视野的计数细胞，然后计算出从滤膜穿过向下室进入的细胞数，即平均每个视野的细胞数，表示细胞的迁移能力。

1.2.5 细胞侵袭试验  在Transwell小室的微膜上均匀平铺基质胶（Matrigel），制作凝胶备用。计算从滤膜穿过向下室进入的细胞数，用每个视野的细胞数表示细胞的侵袭能力。

1.2.6 Western blot法检测相关蛋白表达  接种、培养、收集细胞、给药方法同上。然后加入RIPA裂解液对细胞进行裂解，离心10 min，速率设定为10000 r/min，离心半径为15 cm，收集沉淀，获取总蛋白。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后湿法转硝酸纤维素膜，分别在一抗中浸入膜，在4℃温度下孵育过夜。漂洗后加入二抗中，在室温下进行1～2 h孵育。一抗、二抗稀释比例分别为1：100、1：500，漂洗过程中充分利用三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（TBST）。取出膜后漂洗，漂洗过程中充分利用PBS，将增强化学发光液滴加在膜上，在凝胶成像系统中曝光。采用Quantity One软件，统计各蛋白灰度值。将AKT的磷酸化水平用p-AKT和AKT灰度值的比值表示，将相应蛋白的相对表达量用MMP-2、MMP-9、p27、Cyclin D1、PTEN和内参GADPH灰度值的比值表示，每组试验重复3次。

1.3 观察指标

观察各组细胞活力、细胞周期、细胞迁移、侵袭能力。同时，记录各组细胞AKT信号通路、细胞周期相关蛋白、细胞MMP表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS21.0统计学软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力、细胞周期、细胞迁移、侵袭能力比较

联合用药组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），细胞周期G1显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05）。顺铂组、紫杉醇组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于空白对照组（P<0.05），细胞周期G1均显著高于空白对照组（P<0.05），但顺铂组、紫杉醇组细胞活力、细胞周期G1、S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力之间的差异均不显著（P>0.05），见表1。

2.2 各组细胞AKT信号通路、细胞周期相关蛋白、细胞MMP表达比较

联合用药组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），顺铂组、紫杉醇组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于空白对照组（P<0.05），但顺铂组、紫杉醇组PTEN/GADPH、P-AKT/AKT、P27/GADPH、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达之间的差异均不显著（P>0.05）。见表2。

3讨论

本研究结果表明，联合用药组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），细胞周期G1显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），顺铂组、紫杉醇组细胞活力、细胞周期S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力均显著低于空白对照组（P<0.05），细胞周期G1均显著高于空白对照组（P<0.05），但顺铂组、紫杉醇组细胞活力、细胞周期G1、S、G2、细胞迁移、细胞侵袭能力之间的差异均不显著（P>0.05），为紫杉醇联合顺铂化疗治疗甲状腺癌提供了依据。紫杉醇和顺铂能够使细胞周期在G1期或G2/M期停滞，将其设定为靶点，从而对肿瘤细胞增殖进行抑制，类似于大部分抗肿瘤药物。

P27能够发挥转译后修饰作用，能够对细胞从G1期到S期的过程进行干预，负性调控细胞周期。相关医学学者在1991年从甲状腺癌腺瘤中发现了CyclinD1基因。相关医学研究[5]表明，CyclinD1过表达能够促进细胞周期G1期的缩短，为细胞向S期进入提供良好的前提条件，最终造成细胞过度增殖，促进肿瘤的发生。在甲状腺乳头状癌中，CyclinD1显著过表达，同时直接影响肿瘤转移、预后。从这里可以看出，将甲状腺癌细胞中CyclinD1下调、p27上调能够阻滞癌细胞增殖。

在甲状腺癌患者的预后影响因素中，恶性肿瘤的侵袭与转移发挥着重要作用，在肿瘤侵袭、转移中，细胞外基质降解是必要步骤，而在细胞外基质降解中，MMPs是最重要的一组蛋白酶，在细胞肿瘤转移中发挥了极为重要的作用。在甲状腺瘤恶性进展或转移过程中，MMP-2、MMP-9发挥着极为重要的作用，同时过表达于恶性甲状腺癌组织中。因此，通过干扰MMPs的表达，在一定程度上抑制甲状腺癌细胞的侵袭、转移。

多条信号通路的调节在肿瘤的发生发展过程中均发挥着极为重要的作用，在甲状腺癌的发生过程中，P13K/AKT异常激活发挥着极为重要的作用，通過调节该信号通路能够在极大程度上对甲状腺癌的发生发展造成影响。PTEN基因能够使细胞停止分裂，进入细胞凋亡，从而阻止不受控制的细胞增殖，进而抑制肿瘤形成。PTEN的过度表达能够将AKT活性下调，从而将p27表达上调，将Cyclin D1表达下调，进而造成细胞周期停滞。PTEN缺失组织会向肿瘤演变，因此，将PTEN表达上调、将AKT活性下调能够在极大程度上对肿瘤细胞增殖进行抑制。

相关医学研究表明[15-20]，紫杉醇联合顺铂可能通过将p27、PTEN表达上调，使MMP-2、MMP-9、Cyclin D1表达下调，对AKT磷酸化进行抑制增强甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移、侵袭的抑制作用。本研究结果表明，联合用药组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于顺铂组、紫杉醇组、空白对照组（P<0.05），顺铂组、紫杉醇组PTEN/GADPH、P27/GADPH表达均显著高于空白对照组（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达均显著低于空白对照组（P<0.05），但顺铂组、紫杉醇组PTEN/GADPH、P-AKT/AKT、P27/GADPH、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表达之间的差异均不显著（P>0.05），与上述相关医学研究结果一致，说明在甲状腺癌治疗中，紫杉醇联合顺铂治疗效果优于单独治疗组，其对甲状腺癌细胞增殖造成影响的机制可能为通过PTEN/AKT信号通路。

总之，紫杉醇联合顺铂能够显著抑制甲状腺癌细胞SW579增殖、迁移，值得在临床上推广。但是，本研究存在不足之处，表现在具有较少的样本量、较短的治疗时间，没有追踪远期疗效，造成研究结果可能存在偏差，今后临床应该扩大样本量，延长随访时间，进一步深入细致的研究。

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