液质联用法测定蔬菜和水果中的烟酰胺单核苷酸

李东芹

液质联用法测定蔬菜和水果中的烟酰胺单核苷酸

李东芹

（华中农业大学 作物遗传改良国家重点实验室，湖北 武汉 430070）

建立B-烟酰胺单核苷酸的液相色谱-串联质谱快速测定方法。采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱进行色谱分离，流动相为甲醇与0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱12 min，流速为0.3 mL/min,在质谱正离子模式下用多反应离子监测模式进行定量测定。在0.1425-228 μg/L的质量浓度范围内线性良好（=0.9998），回收率为86.6%~108%，RSD为3.4%；重现性好，RSD为2.22%；方法的定量限0.1425 μg/L（/为10），检出限为0.07 μg/L（/为5）。该方法灵敏度高、选择性好，适用于蔬菜、水果营养价值分析及药用价值开发研究中B-烟酰胺单核苷酸的快速测定。

烟酰胺单核苷酸；西兰花；卷心菜；牛油果；液相色谱-串联质谱

烟酰胺单核苷酸（NMN）是人体内一种内源性物质，由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成，随后NMN又在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。NMN在人体内的生理作用都是通过转化为NAD+完成[1]。已有的科学研究表明，NMN可以改善缺血性脑损伤[2]和阿尔茨海默症[3]，对帕金森病[4]、退行性疾病[5-6]和肥胖[7]具有治疗作用，还可减轻心肌缺血再灌注损伤[8]及脑出血脑梗出血损伤[9]等；近期研究最热的是NMN在延缓衰老[10]、医药保健品方面的开发应用。美国科学家David Sinclair博士已经在小鼠身上证实了NMN具有逆转生理老化的作用[11-12]，但应用于人体尚在研究中。除了含NMN活性成分的药品和保健品外，天然食物如蔬菜、水果、肉类[13]和哺乳动物的乳液中[14]也发现NMN。质谱定量具有灵敏度高、选择性好等特点，可以有效降低基质干扰带来的测定误差。鉴于NMN诸多的保健治疗作用，测定蔬菜、水果中NMN的含量具有重要的实用价值和意义，它不仅可为蔬菜、水果营养价值及药用价值研究提供NMN的快速定量方法，还可为人们膳食营养搭配及病人的食疗保健提供理论指导。

1 仪器、试剂与材料

仪器：4000Qtrap串联三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex公司），LC-20AD高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），Milli-pore超纯水仪（美国Millipore公司），超声波（宁波新芝），万分之一天平（梅特勒公司），蠕动泵（Hamilton公司）。

试剂：甲醇（色谱纯，默克公司），超纯水，Beta-烟酰胺单核苷酸（≥98%，LC_MS级别，医恩医疗系统研发（上海）有限公司生产），乙酸（色谱纯），1 mL医用注射器，0.22 μm微孔滤头（上海安普）。

材料：牛油果、西兰花、卷心菜均在华中农业大学市场采购。

2 实验方法

2.1 样品制备

将牛油果、西兰花、卷心菜切成小块，精确称取3.5 g左右（每个样品2个重复），加入5 mL、50%的甲醇水溶液，超声萃取30 min，用1 mL医用注射器取上清，经0.22 μm过滤头过滤后立即上机测试。

2.2 仪器条件

色谱条件：岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0，5 μm）色谱柱，样品室为室温；流动相：A为0.1%的乙酸水溶液，B为含2 mmol/L醋酸铵的甲醇溶液；流速为0.3 mL/min，柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。梯度洗脱条件：0 min B与A体积比为5∶95，3 min B与A体积比为35∶65，5 min B与A体积比为100∶0，8.1 min B与A体积比为5∶95，12 min程序结束。

质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测（MRM）扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5500 V，离子源温度为500 ℃，离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。

3 结果与分析

3.1 质谱参数优化

用蠕动泵直接进样，对228 μg/L的NMN标准品溶液进行Q1扫描分析。在ESI+电离模式下得到NMN的母离子为335.0[M+H]+，ESI–电离模式下得到NMN的母离子为333.2[M–H]–，阳离子模式下离子信号强度远高于阴离子，因此选用ESI+电离模式；再选用子离子扫描模式，一定碰撞能量下将母离子打碎，得到NMN的二级质谱碎片离子（图1）；继续对解簇电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口电压（CXP）等质谱参数进行优化，在DP为53 V、EP为8 V、CE为18 V、CXP为10 V条件下，NMN的母离子、子离子信号强度比例适中，灵敏度最高。选取丰度最大的子离子123.0与母离子组成对组多反应监测MRM离子（335.0/123.0），在优化的参数条件下进行定量分析。

图1 NMN的二级质谱碎片图

3.2 色谱分离条件优化

用质量浓度为28.5 μg/L的NMN标准溶液和岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱来优化洗脱程序及试剂。其他条件相同时20%甲醇水等度洗脱是20%乙腈水信号的2~3倍，因此选用甲醇水组合洗脱；对比20%甲醇水等度洗脱和12 min梯度洗脱，梯度洗脱分离效果更好，色谱图中可以区分出同分异构体（图2）。

图2 色谱图

3.3 样品前处理方法的优化

精确称取3.5 g卷心菜10份，分别加入5 mL超纯水、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇（2个重复），分别在15、30、45、60、75 min取50 μL上清进样分析（进样两次）。结果表明：每种试剂都是在0~30 min区间NMN含量逐渐升高，45 min后有不同程度的下降，60 min后含量基本保持稳定；其中在0%~50%甲醇含量区间，随甲醇含量升高同一时间NMN萃取效率逐渐升高；甲醇含量超过50%以后，萃取效率没有明显提升；30 min以后NMN含量因降解开始下降，萃取试剂含水量越高NMN降解速度越快，甲醇含量越高降解曲线越平稳；但是甲醇含量越高，基质干扰越严重，因此综合考虑选用50%甲醇水溶液超声萃取30 min的前处理方法。

3.4 方法学考察

3.4.1 标准曲线绘制及方法的检出限、定量限

标准溶液配制：精确称取NMN标准品0.0285 g，用超纯水溶解后定容至50 mL容量瓶，得到570 mg/L的NMN标准储备液。用超纯水逐步稀释成228、114、57、28.5、14.25 μg/L浓度梯度的标准溶液。在2.2节中的仪器条件下上机分析。以标准溶液NMN的浓度为横坐标，NMN的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程=21 200–23 800（=0.9998），在0.143~228 μg/L浓度范围内线性关系良好（图3）。

将14.25 μg/L标准溶液连续稀释后上机分析，以目标峰信噪比/=10确定方法的定量限为0.1425 μg/L，以/=5确定方法的检出限为0.07 μg/L。

图3 NMN的标准曲线

3.4.2 精密度实验

28.5 μg/LNMN标准溶液重复进样5次，结果平均值为28.24 μg/L，相对标准偏差为2.2%。

3.4.3 回收率

因为NMN在处理过程中有不同程度的降解，所以加样回收不可行，只能用空白添加计算回收率。因样品中待测物质量浓度在10~30 μg/L范围，所以选择12.5、25、50 μg/L添加。经计算NMN的回收率为86.6%~108%，相对标准偏差为3.4%。

3.5 实际样品检测

分别称取牛油果、卷心菜和西兰花鲜样3.5 g（2个重复），经2.1节方法处理后，在2.2节仪器条件下上机测试，由标准曲线定量得到每100 g牛油果、卷心菜和西兰花鲜样中NMN的含量分别为6.519 μg、4.091 μg、2.30 μg。

4 结论

NMN在帕金森、阿尔茨海默症及糖尿病[15]等疾病治疗中有良好表现，在减缓生物体生理衰退、延长寿命等方面有特殊功效，在药物研制、功能保健食品开发及化妆品领域将有广阔的应用前景。本文建立的蔬菜、水果中NMN的测定方法，具有快速、灵敏、选择性高等特点；前处理简单，不需提纯、浓缩等步骤，不仅可为蔬菜、水果的营养价值分析及药用价值开发研究提供技术支持，还可为人们日常膳食营养搭配和病人食疗保健提供理论指导。

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Determination of nicotinamide mononucleotides in vegetables and fruits by liquid chromatography-mass spectrometry

LI Dongqin

(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

A rapid determination method of B-nicotinamide mononucleotides by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The shim-pack VP-ODS (150 L×2.0 mm, 5 μm) chromatographic column is used for the chromatographic separation. The mobile phase is methanol and 0.1% acetic acid aqueous solution, the gradient elution is 12 min, and the velocity of flow is 0.3 mL/min. Quantitative determination is used for the multi-reaction ion monitoring mode under positive ion model of mass spectrometry. In the concentration range of 0.1425-228 μg/L, the linearity is good (=0.9998), the recovery rate is from 86.6% to108% and RSD is 3.4%. The determination results show that reproducibility is good with RSD of 2.22%. The quantitative limit of the method is 0.1425 μg/L (/was 10), and the detection limit was 0.07 μg/L (/is 5). The method has high sensitivity and good selectivity, and is suitable for rapid determination of B-nicotinamide mononucleotides in vegetable and fruit nutritional value analysis and medicinal value development research.

nicotinamide mononucleotides, broccoli, cabbage, avocado, liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS218

B

1002-4956(2019)09-0057-03

2019-02-14

国家自然科学基金项目（31770878）

李东芹（1978—），女，安徽泗县，硕士，实验师，研究方向为大型仪器分析与实验技术。

E-mail:ldq@mail.hzau.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.015