3种抗HBV核苷(酸)类似物体外抗乙肝病毒作用

龚红菲，庞富华，芮 莹，韦 欧，韦京辰

3种抗HBV核苷(酸)类似物体外抗乙肝病毒作用

龚红菲，庞富华，芮 莹，韦 欧，韦京辰

（桂林医学院 药学院，广西 桂林 541100）

比较3种抗HBV核苷（酸）类似物（拉米夫定、恩替卡韦、替诺福韦）对HepG 2.2.15细胞的毒性作用和对HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表达的抑制效果。用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测药物的细胞毒性；酶联免疫（ELISA）法检测HBsAg 和HBeAg表达水平；PCR-荧光探针法定量检测HBV-DNA含量。结果：在最高浓度200 mg/L时，拉米夫定组存活率为74.72%，恩替卡韦组存活率仅为36.74%，替诺福韦组存活率为95.22%；拉米夫定和替诺福韦对HBsAg、HBeAg表达无明显抑制，恩替卡韦对HBsAg、HBeAg表达有抑制并与其细胞毒性相一致。在第9天，3种药物对HBV-DNA抑制作用明显，在6.25 mg/L浓度时，抑制率均高于90%；3种药物在相同药物浓度下，恩替卡韦对HepG 2.2.15细胞毒性最大，替诺福韦几乎没有细胞毒性，拉米夫定有一定毒性。

抗HBV核苷（酸）类似物；细胞毒性；HBsAg；HBeAg；HBV-DNA

乙型肝炎病毒（HBV）是一种全球常见的血液传播病原体，某些患者可引起肝硬化和肝癌，甚至死亡[1]。目前，FDA批准了两类抗病毒药物用于治疗乙型肝炎，即免疫调节剂（干扰素[IFN]-a和聚乙二醇化干扰素[PEG-IFN]-a）和核苷（酸）类似物（拉米夫定，替比夫定，阿德福韦，替诺福韦[TDF]和恩替卡韦[ETV]）。尽管核苷类似物具有良好的耐受性并表现出早期和强效的抗病毒作用，但在长期治疗期间耐药突变株的出现和肾毒性限制了其药物的使用[2-4]。干扰素和核苷酸停药后，往往又会检测到HBV-DNA，即所谓的“反跳现象”[5]，这使得研究新型的抗乙肝病毒药物显得尤其重要。

目前，抗HBV治疗缺乏特效药，临床常用的药物对HbsAg、HbeAg和HBV-DNA仅有部分抑制作用，或抑制作用不强，抗乙肝病毒药物研究具有很好的前景[6]。在抗HBV体外实验中，阳性药物的选择和药物浓度设定杂乱且效果参差不齐，缺乏可参照性。本文用临床上抗HBV疗效较好的3种核苷（酸）类似物体进行体外抗HBV实验，摸索不同药物浓度下其对抗原及HBV-DNA的抑制效果，为抗HBV药物研究实验中阳性药的选择和浓度设定提供参考。

1 材料

细胞株：HepG 2.2.15细胞由中国人民解放军第302医院提供，本室定期用G418筛选。

药物与试剂：拉米夫定、恩替卡韦和替诺福韦(上海源叶)，G418（Gibco），DMEM（Gibco），胎牛血清（浙江天杭），青霉素-链霉素混合液（NOVON），胰蛋白酶-EDTA消化酶（Solarbio），PBS（Solarbio），HBsAg，HBeAg试剂盒（上海科华），乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（中山大学达安基因）。

2 仪器与设备

CO2培养箱（SANYO），超净工作台（天津市尘埃净化设备厂），倒置显微镜（上海蔡康），酶联免疫检测仪（BioTek），荧光定量PCR仪（基因有限公司），细胞培养瓶（Corning）,96孔板（Corning）。

3 方法

3.1 3种抗HBV核苷（酸）类似物的配置

将拉米夫定、恩替卡韦、替诺福韦溶于DMSO后加入无血清DMEM培养液，混匀，配制成2 mg/L培养液；用含10% DMSO的DMEM培养液按梯度稀释法，稀释成质量浓度为1000、500、250、125、62.5 mg/L的样品溶液。

3.2 细胞培养

将HepG 2.2.15细胞以1×104/mL接种于96孔板，置于37 ℃、5%的CO2培养箱培养24 h后，细胞贴壁且状态良好，去除原有培养基，加入180 μL完全培养基，再加入20 μL上述药物稀释液（药物终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L），每3 d更换相同培养基和药液。同时设置无药物的阴性对照组，收集上清液置–20 ℃保存待测。

3.3 四甲基噻唑蓝（MTT）法检测细胞毒性

第9天收集上清后，96孔板中每孔加入完全培养基100 μL和20 μL MTT，置于培养箱内培养4 h后，去除上清，加入100 μL DMSO，置摇床轻轻振荡10~15 min，用酶标仪在490 nm处读取吸光度OD值，根据以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率=（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%

3.4 酶联免疫（ELISA）法检测HBsAg和HBeAg表达的抑制率

将第3、6、9天的上清液按HBsAg和HBeAg试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm读取吸光度OD值，根据以下公式计算HBsAg和HBeAg的抑制率：

抑制率/%=[（对照组平均OD值–实验组平均OD值）÷对照组平均OD值]×100%

3.5 PCR-荧光定量法定量检测HBV-DNA

将第3、6、9天的上清液根据乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书步骤操作，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，检测其荧光信号，依据预循环值（q值）实现对未知样本的定量检测。

3.6 统计学处理

用SPSS 23.0统计软件进行分析，OD值用均数±标准差（¯±s）表示，实验数据采用重复测量方差分析，<0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 对HepG 2.2.15细胞毒性

MTT结果显示：与阴性对照组相比较，在最高质量浓度为200 mg/L时，拉米夫定组存活率为74.72%，恩替卡韦组存活率仅为36.74%，替诺福韦组存活率为95.22%，3种药物在相同药物浓度下，恩替卡韦 对HepG 2.2.15细胞毒性最大，而替诺福韦几乎没有细胞毒性；拉米夫定有一定毒性，介于二者之间，详见 表1。

表1 3种抗HBV核苷（酸）类似物对HepG 2.2.15细胞的毒性作用

注：*者表示与阴性对照组比较<0.05。

4.2 对HepG 2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的抑制

与阴性对照组相比，拉米夫定及替诺福韦对HepG 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达无明显抑制；恩替卡韦对HBsAg、HBeAg表达有抑制，并与其细胞毒性相一致，且呈现明显的时间依赖性和浓度依赖性抑制，在第9天达到峰值，详见表2和表3。

表2 3种抗HBV核苷（酸）类似物对HepG 2.2.15细胞HBsAg表达的影响

注：*者表示与阴性对照组比较<0.05。

表3 3种抗HBV核苷（酸）类似物对HepG 2.2.15细胞HBeAg表达的影响

注：*者表示与阴性对照组比较<0.05。

4.3 对HepG 2.2.15细胞HBV-DNA表达的抑制

从表4可知，3种抗HBV核苷（酸）类似物（拉米夫定、恩替卡韦、替诺福韦）在设定的质量浓度范围内，均有良好的体外抑制HBV-DNA作用，在第9天，在6.25 mg/L浓度时抑制率均高于90%。

表4 3种抗HBV核苷（酸）类似物对HBV-DNA 的抑制作用

注：*者表示与阴性对照组比较<0.05。

5 讨论

核苷（酸）类似物主要通过抑制病毒的反转录和DNA合成发挥抗病毒作用。拉米夫定通过抑制HBV-DNA多聚酶活性来治疗乙型肝炎病毒[7]，而对病毒mRNA无作用, 为中国临床上抗乙肝的一线药物[8]。恩替卡韦是继拉米夫定后的第二个获得批准上市并用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物，对于初治患者及拉米夫定治疗失效患者均具有明显的抗HBV作用[9]。替诺福韦是替诺福韦-5-单磷酸腺苷类似物脂类的前体药，该药作用机理和恩替卡韦是一致的，均是进入人体后被体内细胞激酶磷酸化，之后生成替诺福韦二磷酸而发挥其药效，二磷酸能够与体内5-三磷酸脱氧腺苷酸竞争性参与乙肝病毒的合成，其抗HBV活性良好，并具有显著的基因屏障作用[10-12]。

本研究中，在相同的药物浓度下，恩替卡韦对HepG 2.2.15细胞毒性最大，替诺福韦几乎没有细胞毒性，拉米夫定有一定毒性。在细胞存活率大于70%时，3种药物对HBsAg和HBeAg表达无明显抑制作用，均通过抑制HBV-DNA复制来治疗乙型肝炎病毒。因此，在抗HBV体外实验中，如果选择拉米夫定和替诺福韦作为阳性药，因其对细胞的增殖影响不大，且在6.25 mg/L时对HBV DNA仍有很强抑制作用，可选择的浓度范围比较广；而恩替卡韦对细胞增殖抑制作用比较强，质量浓度为6.25 mg/L时对细胞抑制为76.48%，增加浓度则对细胞抑制更明显。为避免出现抑制细胞而抑制DNA表达的现象出现，影响科研实验的对比，选择恩替卡韦作为阳性药时，药物质量浓度设定低于6.25 mg/L更为合理。用HepG 2.2.15细胞进行体外抗HBV实验，应结合药物对HepG 2.2.15细胞的毒性作用，在不影响细胞增殖同时又能抑制HBsAg、HBeAg或HBV DNA表达，阳性药设定合适的药物浓度范围更具有可比性和科学性。

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Effect of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues on hepatitis B virus in vitro

GONG Hongfei, PANG Fuhua, RUI Ying, WEI Ou, WEI Jingchen

(College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541100, China)

The comparison on the toxicity of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues (lamivudine, entecavir and tenofovir) on HepG 2.2.15 cells and their inhibitory effects on the expression of HBsAg, HBeAg and HBV-DNA is carried out Tetramethylthiazole blue (MTT) assay is used to detect the cytotoxicity of drugs, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is adopted to detect the expression level of HBsAg and HBeAg, and quantitative detection of HBV-DNA content by PCR-fluorescence probe is conducted. The results are that at the highest concentration of 200 mg/L, the survival rate of lamivudine group is 74.72%, the survival rate of entecavir group is 36.74%, and the survival rate of tenofovir group is 95.22%. Lamivudine and tenofovir don’t inhibit the expression of HBsAg and HBeAg, but entecavir has inhibited the expression of HBsAg and HBeAg, which is consistent with their cytotoxicity. In the 9th day of PCR experiment, the inhibition of HBV-DNA by three drugs is obvious, and at 6.25 mg/L concentration, the inhibition rate is higher than 90%. Under the same concentration of three drugs, entecavir has the greatest cytotoxicity to HepG 2.2.15, tenofovir had almost no cytotoxicity, lamivudine had certain toxicity.

anti-HBV nucleoside (acid) analogues; cytotoxicity; HBsAg; HBeAg; HBV-DNA

R965.1

A

1002-4956(2019)09-0045-04

2019-02-23

国家自然科学基金项目（81560574）资助

龚红菲（1993—），女，广西兴业，在读硕士研究生，研究方向为抗肿瘤抗病毒药理。

E-mail: 850699627@qq.com

韦京辰（1976—），女，广西桂林，硕士，副教授，研究方向为抗肿瘤抗病毒药理研究。

E-mail: 82579354@qq.com

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.012