艾灸血清对体外人黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性的影响

成玉,牛天慧,郭广进,吕景晶,马莉,赵广,周冬梅

(1.首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010;2.空军总医院,北京 100042;3.首都医科大学,北京 100069)

白癜风是一种进行性脱色性疾病,以皮肤或黏膜色素减退为特征,该疾病会影响患者的外在形象,对患者的生活质量影响较大。目前白癜风的发病机制尚无统一定论,但已经确定表皮功能性黑素细胞破坏是其主要的病理基础[1]。目前临床治疗白癜风的方法较多,主要包括糖皮质激素治疗、钙调神经磷酸酶抑制剂治疗、光疗等[2],但临床疗效不确切,治愈率还有待提高,因此探究其他高效治疗白癜风的方法具有重要的临床意义。艾灸是一种利用点燃的艾绒在腧穴上熏灼的疗法,艾灸治疗白癜风由来已久,是治疗白癜风有效的方法之一,我国《白癜风中医治疗专家共识》在非药物外治疗法中也推荐了艾灸疗法[3],但目前对于艾灸治疗白癜风的作用机制尚处于初级研究阶段。鉴于目前的研究现状,本研究对豚鼠进行艾灸治疗,并在治疗结束后的不同时间段采用豚鼠血清体外培养正常人黑素细胞,观察艾灸血清对正常人黑素细胞的增殖、黑素含量和酪氨酸酶活性的影响,从调节黑素细胞角度,探讨艾灸治疗白癜风的可能机制,以期为艾灸治疗白癜风提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

豚鼠购自于南京安立默科技有限公司,许可证号[SCK(苏)2010-0002],雌雄兼备,体重 250～350 g,雌雄分笼饲养,随机分为5 组,每组10 只,分别为空白对照组、T-1 组(艾灸治疗结束后即刻)、T-2 组(艾灸治疗结束后1 个月)、T-3组(艾灸治疗结束后2 个月)、T-4 组(艾灸治疗结束后 3 个月)。各组豚鼠背部脱毛约2 cm×2 cm,除空白对照组外,其余4 组豚鼠均进行艾灸治疗,取穴为经外奇穴“灸癜风”和“阿是穴”。“灸癜风”取穴参考《实验针灸学》动物穴位图谱,以比较解剖和骨度分寸法为依据模拟定位[4]。“阿是穴”即豚鼠背部脱毛区。穴上3 cm 处悬灸,采用温和灸补法,每穴每次约10 min,灸至动物发出嘶叫声、不能耐受为度。每日1 次,艾灸治疗疗程为1 个月。空白对照组仅采用同法固定,不进行艾灸治疗。

1.2 采集艾灸血清样本

艾灸治疗结束后即刻及1 个月、2 个月、3 个月后,采集豚鼠血清。依据文献[5]经腹主动脉采血(无菌操作),将所取动脉血静置 1 h 后,以 1500 r/min 转速,离心 10 min,提取血清,0.22 μm 滤器过滤分装后,置于-80oC 冰箱中存储待测。

1.3 细胞培养与接种

采用M-254-500型培养液(美国Invitrogen公司),体外培养人黑素细胞(北京清源昊生物科技有限公司)。取对数生长期的人黑素细胞,调整细胞浓度为 2×105/mL,接种于96 孔板,150 μL/孔(用于细胞增殖检测);或接种于6 cm 平皿,2 mL/孔(用于细胞周期、黑素含量和酪氨酸酶活性测定)。CO2细胞培养箱孵育至细胞完全贴壁。

1.4 细胞增殖检测(CCK-8 法)

5%、10%及 15%浓度的各组血清,分别处理人黑素细胞 24 h。弃上清,加入 100 μL CCK-8 溶液,37oC 孵育4 h,测定450 nm 吸光度值(OD 值),空白试剂作为校正。细胞增殖率(%)＝[(实验组平均OD 值-空白试剂平均 OD 值)/(对照组平均 OD 值-空白试剂平均 OD 值)]×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

5%浓度的各组血清,分别处理人黑素细胞 24 h。胰酶消化后收集细胞,预冷PBS 缓冲液洗涤细胞2 次,加入乙醇,4oC 固定30 min,弃去上清,预冷PBS 缓冲液洗涤细胞 1 次,严格参照细胞周期检测试剂盒(美国Becton-Dickinson 公司)说明书进行操作,依次加入200 μL PBS 缓冲液和 5 μL RNA 酶,37oC 孵育 30 min,加入 0.5 mL PI 溶液(50 μg/mL),避光孵育 30 min,过滤(300 μm 尼龙网模)后,流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 黑素含量测定(NaOH 溶解法)

5%浓度的各组血清,分别处理人黑素细胞 24 h。收集细胞沉淀,1 M NaOH 溶液处理细胞,测定 450 nm吸光度值(OD 值),空白试剂作为校正。黑素含量影响率(%)＝[(实验组平均 OD 值-空白试剂平均 OD 值)/(对照组平均OD 值-空白试剂平均OD 值)]×100%。

1.7 酪氨酸酶活性测定(左旋多巴氧化法)

5%浓度的各组血清,分别处理人黑素细胞 24 h。收集细胞沉淀,PBS 缓冲液洗涤2 次,加入90 μL 细胞裂解液TritonX-100(10 mL/L),充分震荡溶解后,加入10 μL 左旋多巴溶液(1%),37oC 孵育 30 min,测定450 nm 吸光度值(OD 值),空白试剂作为校正。酪氨酸酶活性增长率(%)＝[(实验组平均OD 值-空白试剂平均OD 值)/(对照组平均OD 值-空白试剂平均OD 值)]×100%。

1.8 统计学方法

统计分析采用SAS9.2 软件。对每组计量资料数据进行正态性检验,符合正态分布的用均数±标准差表示,多种数据之间进行方差齐性检验,经验证后,多组独立样本的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD-t检验;两组独立样本的比较采用成组t检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 艾灸血清对细胞增殖的影响

CCK-8 实验结果显示,各组5%和10%艾灸血清之间,经单因素方差分析,差异具有统计学意义(F＝14.677,P＝0.001;F＝8.386,P＝0.009),而各组 15%艾灸血清之间无差异(F＝0.576,P＝0.582)。

LSD-t检验结果显示,艾灸血清浓度为 5%时,T-1组和 T-2 组的细胞增殖均分别高于空白对照组(t＝18.326,P＝0.000;t＝20.897,P＝0.000),且 T-2 组的细胞增殖高于T-1 组(t＝5.843,P＝0.000);艾灸血清浓度为10%时,T-2 组的细胞增殖高于空白对照组(t＝18.642,P＝0.000)。成组t检验结果显示,T-2 组 5%艾灸血清的细胞增殖高于 T-2 组 10%艾灸血清(t＝9.415,P＝0.000)。详见图1。

依据CCK-8 实验结果,后续实验采用5%艾灸血清24 h 进行研究。细胞周期检测结果显示,艾灸血清浓度为5%时,T-2 组和T-3组的S 期细胞比例均分别高于空白对照组(t＝21.534,P＝0.000;t＝16.248,P＝0.000)。详见图2A、2B。

2.2 艾灸血清对人黑素细胞中黑素含量的影响

单因素方差分析结果显示,各组人黑素细胞中黑素含量之间差异具有统计学意义(F＝52.850,P＝0.000)。LSD-t检验结果显示,T-1 组、T-2 组、T-3组和T-4 组的人黑素细胞中的黑素含量均高于空白对照组,差异均有统计学意义(t＝13.259,P＝0.000;t＝59.157,P＝0.000;t＝32.746,P＝0.000;t＝12.327,P＝0.000)。

此外,T-2 组的人黑素细胞中的黑素含量分别高于 T-1 组、T-3组和 T-4 组(t＝40.940,P＝0.000;t＝15.779,P＝0.000;t＝29.918,P＝0.000)。详见图3。说明艾灸血清能够增加体外培养人黑素细胞黑素含量,而且这种影响作用在艾灸治疗结束后 3 个月均存在,尤其在艾灸治疗结束后1 个月(T-2 组)的效果最为明显。

图1 各组不同浓度艾灸血清对人黑素细胞活性的影响

图2 艾灸血清对人黑素细胞周期的影响

图3 各组艾灸血清对人黑素细胞黑素含量的影响

2.3 艾灸血清对人黑素细胞中酪氨酸酶活性的影响

单因素方差分析结果显示,各组人黑素细胞中酪氨酸酶活性之间差异有统计学意义(F＝26.988,P＝0.000);LSD-t检验结果显示,T-2 组和T3组人黑素细胞中的酪氨酸酶活性均高于空白对照组,差异有统计学意义(t＝59.157,P＝0.000;t＝32.746,P＝0.000),且T-2组的人黑素细胞中的酪氨酸酶活性高于T-3组,差异有统计学意义(t＝1.653,P＝0.000)。详见图4。说明艾灸血清可增加体外培养人黑素细胞中酪氨酸酶活性,而且这种影响作用在艾灸治疗结束后 1 个月(T-2 组)最明显。

图4 各组艾灸血清对人黑素细胞中酪氨酸酶活性的影响

3 讨论

白癜风属中医学“白癜”“白驳风”“白驳”“驳白”“斑白”“斑驳”等范畴,患者皮损为局限性或泛发性的白斑片,中医学认为局部皮损变化与脏腑气血盛衰存在密切的关系,白色主寒证、虚证、脱血、夺气,《灵枢·五色》：“青黑为痛,黄赤为热,白为寒。”《素问·皮部论》：“其色多青则痛,多黑则痹,黄赤则热,多白则寒,五色皆见则寒热也。”可见白癜风辨证应属寒[6-9]。“寒者热之,热者寒之”是中医学治疗的重要思路,白癜风属寒,故应“从寒辨治”,艾灸疗法通过温热之力和艾叶的功效能起到温经散寒、升阳举陷、扶阳固脱、行气通络的功效,《五十二病方•白处》中就有火灸治疗白癜风的记载[10],之前的临床研究亦显示,艾灸治疗白癜风有确切的疗效[11-14]。目前对艾灸治疗白癜风作用机制的研究较少,尚处于初级研究阶段,本研究就此展开探讨。

在前期临床试验中,本课题组发现部分多处皮损的白癜风患者除靶皮损之外的皮损也出现了复色的现象,因此推测在艾灸治疗的过程中机体会产生一些活性物质促进白斑复色,且不仅仅是局部皮肤组织中存在这些活性物质,血清中可能也存在。戴历群等[15]研究证实艾灸血清可抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6 的表达,这也从侧面说明了艾灸治疗产生的活性物质存在于血清中。皮肤和毛囊中的黑素细胞合成的黑素体转移到周围的角质形成细胞,进而形成皮肤色素[16],现代医学认为,在免疫、神经精神等因素的作用下导致黑素细胞功能障碍或缺失是白癜风的病理基础,因此黑素细胞的增殖及其活性对白癜风患者皮肤复色起着决定性的作用。本课题组前期的实验发现,艾灸血清可促进人黑素细胞增殖、黑素合成,且可增加酪氨酸酶活性,但对其远期的作用尚不清楚[17-18]。本研究结果显示,艾灸治疗结束后,艾灸血清对人黑素细胞的细胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性仍有影响,且随着时间的推移,艾灸血清对人黑素细胞的细胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性的影响程度呈现出先上升后下降的峰型变化,以 T-2 时间点的影响最为显著,可见艾灸治疗白癜风存在远期效应,在艾灸治疗结束后 1 个月仍能显著影响人黑素细胞生长。本研究艾灸血清对人黑素细胞中酪氨酸酶活性的影响,T1 组没有统计学差异,但有升高作用的趋势;T2 组开始显示差异,说明艾灸对酪氨酸酶影响作用缓慢,但持久,在艾灸治疗结束后仍有持续增高作用,并在艾灸治疗结束后1 个月达到最高,且下降缓慢,结束艾灸2 个月与第1 个月统计学无差异,结束艾灸治疗第3 个月下降才较为明显。因此,艾灸治疗缓效,但持久,治疗结束后仍有持续增高作用。本课题组前期的实验发现,艾灸血清可能是通过影响SCF/c-kit 信号转导通路来起到调节人黑素细胞生长的作用[16]。在后续的研究中将继续研究艾灸治疗结束后艾灸血清对c-kit、SCF 蛋白表达的影响,以进一步分析艾灸治疗白癜风存在远期效应的可能机制。

综上所述,艾灸血清可有效促进人黑素细胞增殖、黑素含量和酪氨酸酶活性,而且这种影响作用在艾灸结束后3个月都存在,尤其在艾灸治疗结束后1个月该效果最为明显。提示艾灸对人黑素细胞生长存在远期效应。本研究为临床采用艾灸治疗白癜风提供了实验依据。