针刀干预对膝骨性关节炎模型兔股直肌Akt/mTOR通路的调控作用*

付昕怡，马诗凝，张 伟，谢汶姗，陈烯琳，郭长青

(北京中医药大学，北京 100029)

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是慢性、退行性肌肉骨关节常见病，常因膝关节周围软组织受损[1]导致关节软骨应力失常而发生软骨退变甚至缺失。临床研究显示，针刀对膝骨关节炎具有良好的治疗效果[2]，进一步探究其作用机制对临床应用和治疗思路有着重要意义。纵观前期研究，多以电针为主要干预手段来研究Akt/mTOR信号通路及其对KOA的影响[3]。研究证实，电针可通过上调PI3K的表达，调控Akt/mTOR通路，促进骨骼肌卫星细胞的增殖，延缓去神经骨骼肌衰老[4]。而Akt/mTOR通路的激活是如何促进骨骼肌细胞修复？深入研究发现，Akt/mTOR通路及其下游p70S6K和PHAS-1/4E-BP1通路的激活与骨骼肌纤维大小的调节密切相关，并能促进骨骼肌蛋白质合成，抑制肌肉萎缩[5]。而针刀是否能通过影响Akt/mTOR通路来促进股直肌细胞的损伤修复进而实现治疗KOA？本研究以膝关节骨性关节炎(KOA)模型兔为载体，进行相应的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6月龄新西兰雄兔36只，体质量约3.20 kg ，SPF级，购自北京科宇动物养殖有限责任公司(动物许可证号:SYXK 京 2016-0013)，动物均单笼饲养在中国中医科学院中药研究所大实验动物室(SPF级)，室温(20±2)℃，湿度40%～70%。

1.1.2 主要试剂与仪器 Trizol(美国Invitrogen公司)，氯仿、异丙醇、DEPC水、无水乙醇(均为北京化学试剂有限公司);琼脂糖、PCR引物Rnasefree-dH2O、10×RNA Loading buffer(均为广州复能基因技术有限公司);超净工作台(ABI9700型，苏州净化设备厂);荧光定量PCR仪电热恒温(7500型，ABI公司);鼓风干燥箱(DH-101，北京利康科技发展有限公司);3 mL、5 mL玻璃匀浆器(海门弘潘实验器材制造有限公司);低温高速离心机、高速冷冻离心机(均为美国Sigma公司);FM100 制冰机(美国GRANT公司);-20℃/4℃冰箱(日本SANYO公司);-80℃冰箱(中国中科美菱公司);Biophotometer紫外分光光度计(Eppendorf公司);高压灭菌锅(上海予腾生物科技有限公司)。

1.2 分组及造模

将36只兔按体重编号，并按照随机数字表法随机分为正常组、模型组、针刀组、电针组，每组9只，其中1只用于造模后检测是否造模成功。实验期间严格按照动物伦理学要求对待动物。

参照改良的Videman左后腿伸直位固定制动法[6]造KOA模型。两研究人员一人抓取两前肢，一人抓取两后肢，将兔子仰卧固定于兔台。先将树脂绷带放于65～85℃热水中，然后单手将兔左后腿的膝关节保持在伸直位(膝关节伸直180°，踝关节背屈60°)，另一手在膝关节和大腿根部分别缠绕一层脱脂棉，后将树脂绷带取出固定膝关节和踝关节，再用高分子绷带从腹股沟逐层螺旋式包绕至趾尖，待定型后在外层缠绕防啃咬绷带，并用医用胶带固定。为方便观察造模后是否影响兔腿血供，将足趾末端裸露。每日检查模型制动情况，松动脱落则加固，血供受限则半松解制动。制动6周，后各组随机抽取1只处死，取关节软骨观察其形态学，若示造模成功则拆除模具。

1.3 干预方法

各组实验动物按如下方法进行干预治疗。①正常组：常规饲养，不予任何处理。②模型组：造模后同期常规饲养，不予干预治疗。③针刀组：拆除模具1周后予以针刀干预,每周2次，治疗4周。具体操作方法：股内、外侧肌腱、股直肌肌腱、股二头肌肌腱的止点：依次松解各肌腱延续处，针刀刃与肌腱平行，刀柄垂直于皮肤刺入，向肌腱附着在骨连接的方向做“十字”疏通松解；另在膝关节周围，沿肌肉肌腱的走行进行循按触摸，若遇硬结节或条索则用记号笔标记，消毒后，针刀刃平行于条索结节所在的肌肉肌腱纹理走向，垂直刺入松解。操作完成后即拔出针刀，用棉球按压针孔片刻止血。④电针组：拆除模具后第8天予以电针治疗。参照《实验针灸学》[7]结合模拟骨度取穴法，针刺血海、梁丘和内、外膝眼穴，用韩式穴位神经刺激仪分别连接梁丘与血海，内膝眼与外膝眼进行电针刺激治疗(波形：疏密波，频率：2/100 Hz，强度:3 mA，10 min/次，3次/周)，以实验兔四肢微颤且无挣扎为度，共治疗4周。

1.4 取材

各组实验兔在干预结束1周后，以3%戊巴比妥溶液予以耳缘静脉注射麻醉(30 mg/kg)，待完全麻醉后将兔左后肢剖皮，逐层分离暴露整个膝关节，于膝关节髌骨上2 cm处取一块0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肌肉，迅速放入液氮罐。

1.5 指标检测

Real-time PCR法检测Akt、mTOR、4EBP1和p70s6k的基因表达:将冷冻的肌肉组织研磨后，采用Trizol法提取各组样本组织中的总RNA，电泳检测RNA质量，并用紫外透射光测定RNA浓度。根据浓度取1 μL总RNA进行逆转录：42℃ 60 min，85℃ 10 min将RNA逆转录为cDNA。引物序列见表1。

将配置好的Real-Time PCR反应液(20 μL体系)混合均匀后离心，迅速置入PCR仪中，扩增程序为：95℃预变性10 min；变性95℃ 15 s、 退火58℃ 35 s、95℃ 15 s，以上扩增循环40次;延伸55℃ 30 s、95℃ 15 s。获得的各样本待测基因的Ct值，以GAPDH的基因作为内参校正，用相对定量2-△△Ct法进行分析处理，即相对mRNA表达量=2-△△Ct。

表1 引物和探针序列表

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组 Akt、mTOR基因表达比较

实时荧光定量PCR法检测Akt、mTOR的基因表达，模型组均低于正常组(P<0.01);电针干预后，电针组与模型组相比：mTOR的基因表达电针组高于模型组(P<0.01)，但Akt的基因表达电针组与模型组无显著差异(P>0.05)；针刀干预后，针刀组与模型组相比：Akt、mTOR的基因表达针刀组均高于模型组(P<0.05或P<0.01)；见表2、封三彩图1、图2。

表2 各组兔左侧股直肌Akt、mTOR的mRNA表达水平(即与GAPDH的比值)

注:与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各组4EBP1、p70s6k基因表达比较

实时荧光定量PCR法检测p70s6k的基因表达，模型组低于正常组(P<0.05); 电针干预后，电针组与模型组相比： p70s6k的基因表达电针组高于模型组 (P<0.01);针刀干预后，针刀组与模型组相比：p70s6k的基因表达针刀组高于模型组(P<0.01)；4EBP1的基因表达，4组之间无显著差异(P>0.05)。其他组间比较均无显著差异。见表3、封三彩图1、图2。

注:与正常组相比，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。图2 各组实验兔股直肌Akt、mTOR、4EBP1和p70s6k的mRNA表达比较

组别n4EBP1p70s6k正常组81.00±0.001.00±0.00模型组80.88±0.800.78±0.07∗针刀组80.92±0.080.85±0.07△△电针组80.90±0.090.86±0.09△△

注:与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨论

KOA属中医学“膝痹”范畴[8]，《张氏医通》云:“膝为筋之府, 膝痛无有不因肝肾虚者, 虚则风寒湿气袭之。”《素问·痹论》云: “痹在骨则重，在脉血凝而不流，在筋则屈不伸”。以上论述指出本病是以肝肾亏虚、风寒湿邪入侵淤阻经脉为病机，以关节疼痛、筋骨屈伸不利为主症的疾病[9]。从传统医学角度讲，针刺治疗本病历史悠久，其相关记载可追溯到《黄帝内经·素问》[10]，而电针是在特定穴位针刺得气后，接以微量脉冲电流，针与电刺激相结合的治疗方法[11]。电针可有效促进血液循环，提高机体免疫功能，辨证分经取穴以平衡阴阳，畅达血气，疏通经络使之通则不痛；更可根据疾病性质选择不同波形频率带动局部肌肉有节律的收缩恢复肌肉功能；相较于单纯针刺，电针可增强刺激量，防止耐受，在改善局部循环代谢和消炎止痛方面有着独特优势[12]。从现代医学角度讲，“筋”对膝骨周围软组织如肌肉、肌腱、韧带、筋膜等进行了高度概括[13]。软组织损伤发生在膝骨关节炎早期，贯穿疾病发展始终，陈玉佩[14]证实，在骨骼肌质量与力量的恢复中，电针可通过促进mTOR的表达、激活肌卫星细胞、协调蛋白合成与分解发挥显著治疗作用。针刀把中医的针与西医的手术刀相结合，在解除关节异常应力、减张减压等方面有着独特的优势，已证实针刀可通过调节骨骼肌蛋白表达[15]、改变生物力学[16]等对KOA有明显疗效。

实验研究从膝骨关节炎肌肉生物力学的角度进行了深入的探索[17]。研究表明股四头肌作为膝骨周围唯一的伸膝肌群，在吸收平衡荷重、防止内环境失稳中发挥动力性作用，膝关节疼痛的存在与股四头肌力量呈负相关，因此股四头肌的肌力下降是KOA症状加重和功能退化的一个重要危险因素[18]。而KOA患者的废用性肌萎缩和肌力减退是由多要素共同影响，前期研究已从分子生物学角度验证Akt/mTOR通路及其下游p70S6K和PHAS-1/4E-BP1通路的激活与骨骼肌纤维大小、蛋白质合成等密切相关[19]。且本团队前期以KOA模型兔为载体的研究发现，针刀干预对膝关节软骨细胞FAK-PI3K-AKT通路有激活作用[20]。因此本次研究，笔者延用改良的Videman左后腿伸直位模型制作方法，进一步探索针刀干预对股直肌细胞Akt/mTOR通路的作用关系，为推进临床更广泛的应用奠定理论基础。

mTOR即雷帕霉素的丝氨酸激酶哺乳动物靶点，通过控制肌源性基因的表达，是调节蛋白质合成、细胞增殖和能量代谢的关键因子，对卫星细胞功能和骨骼肌再生至关重要[21]。mTOR上游激酶之一即为Akt(丝氨酸蛋白激酶)，可直接或间接磷酸化mTOR，从而促进细胞增殖、对抗细胞凋亡[22]。研究表明，抑制mTOR信号传导到其下游因子如4E-BP1和p70s6k，足以减少肌肉生长导致肌肉萎缩[23]。在本次实验中，通过对比分析Akt和mTOR的基因表达结果，发现模型组显著低于正常组，说明Akt、mTOR信号被抑制，证实了KOA兔模型的建立。经过4周干预治疗后，电针与模型组相比，mTOR的基因表达显著升高，而Akt的基因表达仅有上升趋势，无统计学差异，这可能是针刀与电针对股直肌起修复作用的不同之处；针刀组与模型组相比，Akt的基因表达显著上升，同时mTOR的基因表达也明显上调，说明针刀治疗可启动Akt/mTOR通路，并增加蛋白合成，对抗肌肉质量下降，抑制股直肌萎缩治疗KOA，与相关试验结论一致[24]。

p70s6k是mTOR下游靶核糖体蛋白S6激酶1，4EBP1是真核起始因子结合蛋白，二者是mTOR翻译的最佳研究靶点[25]。研究显示p70s6k通过多种机制调控蛋白合成的多个步骤，如p70s6k在Ser-422位点磷酸化4EBP1来控制mRNA的翻译起始，增加核糖体的生物生成，从而保持蛋白质质量和肌肉力量[26]。可见4EBP1的上游信号通路较多，影响复杂，这也从侧面解释了本实验结果中各组间4EBP1的mRNA表达没有差异的原因。另一方面，研究发现虽然4EBP1和p70s6k在mRNA翻译中发挥着重要的作用[27]，但翻译过程中可能存在其他未被鉴定的mTOR靶点，其中一些反式作用因子被认为是抑制TOP mRNA翻译的调控因子(如LARP1)，但其机制和与mTOR活性的关系仍不清楚。此外，研究指出，mTOR/p70s6k通路可调节多种细胞系的生长、增殖，包括成纤维细胞、血管平滑肌和上皮细胞，通路的活性升高，可促进成纤维细胞的增殖[28]。本实验结果表明，经干预治疗后，针刀组和电针组股直肌p70s6k的基因表达均较模型组有显著上调。一方面说明，针刀和电针治疗均可在激活Akt/mTOR通路的同时，也上调p70s6k的基因表达，共同参与蛋白合成的调控，改善股直肌力量，对抗肌肉萎缩；但另一方面，成纤维细胞的增殖可能使萎缩肌纤维化、瘢痕等，不利于肌细胞的恢复。因此，针刀干预对p70s6k和4EBP1的调控和其对股直肌细胞损伤修复的影响还需要进一步的深入研究。

综上所述，针刀和电针干预可通过有效激活mTOR、p70s6k的基因表达，促进损伤或萎缩的骨骼肌细胞得以恢复。此外，针刀还可激活Akt，进而使mTOR的基因表达上调，实现对骨骼肌损伤的协同修复作用，这可能是针刀与电针修复股直肌机制的差异所在，有待后续的深入研究和探索。