绵羊GH基因的Pvu Ⅱ 位点的多态性与其生长性状的关联分析

白俊艳，曹 恒，王 旭，杨又兵，樊红灯，付学言，时坤鹏，董智豪，卢小宁，李新月，郝伟光，李子衡，郑飞扬

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023)

生长激素基因(growth hormone，GH)是影响动物生长性状的主效基因[1]，具有提高饲料转化[2]和促进肌肉中的蛋白质合成[3]等作用。Warwick等[4]首先克隆了绵羊的GH基因并将其定位于11号染色体，绵羊的GH基因由5个外显子和4个内含子构成。刘士力等[5]研究表明，翘嘴鲌生长激素基因全长5 966 bp，其中转录单元长1 648 bp，由5个外显子和4个内含子组成。牛志刚等[6]研究表明，GH基因的AhⅠ位点在新疆褐牛群体中表现为VV、LV和LL三种基因型，而且14月龄的LV和LL基因型个体的体质量、体长均比VV基因型的高，且差异显著(P<0.05)。陈清等[7]研究表明，GH基因内含子3在3个地方鹅品种中检测到AA、AB、BB三种基因型，而且不同基因型与4～10周龄体质量、屠体质量、半净膛质量等19个性状呈显著相关。

许锋[8]在4个蛋用品系鸡中发现GH基因内含子3中存在2个AvaⅠ酶切位点，该酶切位点与蛋型指标关联显著(P<0.05)。董飚等[9]研究表明，在黑羽番鸭群体的公鸭中，GH基因第1内含子的CC基因型的宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腹脂质量、腺肌胃质量显著高于CD基因型和DD基因型(P<0.05)。海汀等[10]研究表明，GH基因对麦洼牦牛的体尺性状无显著影响。以上众多研究表明，GH基因与畜禽的生长性状和屠宰性能有着紧密关系，为此，本研究检测了GH基因内含子Ⅱ在大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊群体中的多态性，并与绵羊体质量和体尺等性状进行了关联分析，以期为绵羊的标记辅助选择和进一步选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因组DNA提取

选择河南省洛阳市马坡镇鲜达牧业杜泊羊50只，河南省洛阳市偃师和伊川县的农户豫西脂尾羊50只，河南省濮阳市台前县的农户小尾寒羊60只，河南省平顶山市宝丰县农户大尾寒羊60只，河南省洛阳市肉羊产业技术体系洛阳综合试验湖羊50只，总计试验绵羊270只。每只羊采集颈静脉血液10 mL，采用ACD抗凝(1∶6)，-20 ℃保存。用上海生工提供的全血DNA试剂盒(SK1262)提取基因组DNA。

1.2 引物设计与PCR扩增

GH基因内含子Ⅱ的引物序列参考施安[11]，引物由郑州鼎国生物技术有限公司合成。引物序列信息具体如下，F: 5′-CTGTTTGCCAACGCTGTGC-3′，R: 5′-CCCAAGCCACGACTGGATAAG-3′，片段大小为693 bp。

PCR扩增反应体系的总体积为15 μL，具体为去离子水3.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA为2 μL，2×TaqPCR Mix为7.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环，72 ℃后延伸7 min；4 ℃保存。

1.3 PCR-RFLP分析

GH基因内含子Ⅱ经限制性内切酶PvuⅡ(5′…CAG↓CTG…3′)消化酶切，依照产品说明书上推荐的酶切消化反应4 h，酶切后的产物在3%的凝胶电泳下检测。酶切反应体系具体为ddH2O 7.4 μL，PCR产物10 μL，10×Buffer 2 μL，限制性内切酶PvuⅡ(10 U·μL-1) 0.6 μL，总计酶切反应体系20 μL。

1.4 关联分析

GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点多态性与绵羊生长性状进行关联分析，分析模型如下：

yijkl=μ+Pi+Sj+Mk+eijkl。

(1)

式(1)中：yijkl为性状表型值；μ为总体均值；Pi为品种效应(i=1，2，3，4，5)；Sj为性别效应(j=1，2)；Mk为第k种基因型效应；eijkl为残差效应。结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的PCR扩增产物检测

五个绵羊群体的GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的PCR扩增产物的检测结果见图1，从图1可以看出，GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的扩增片段约为693 bp，与目的条带一致，且条带清晰、无杂带，可以进行后续PCR-RFLP分析。

2.2 绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的PCR-RFLP分析

大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊的GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点进行酶切结果见图2-图5，酶切后检测到AB基因型(264 bp/429 bp/693 bp)和BB基因型(264 bp/429 bp)共两种基因型。

M，Marker DL2000；1、2、3、4、5分别为大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊。M， Marker DL2000; 1， 2， 3， 4 and 5 were Large-tailed Han sheep， Small-tailed Han sheep， Yuxi fat-tailed sheep， Dorper sheep and Hu sheep， respectively.图1 五个绵羊群体的GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的检测结果Fig.1 Detection of PvuⅡ locus in intron Ⅱ of GH gene in sheep populations

1、6，AB基因型；2、3、4、5，BB基因型；M，Marker DL2000。1, 6: AB genotypes; 2, 3, 4, 5: BB genotypes; M, Marker DL2000. 图2 小尾寒羊的GH基因PvuⅡ位点多态性Fig.2 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Small-tailed Han sheep

5、6，AB基因型；1、2、3、4，BB基因型；M，Marker DL2000。5, 6: AB genotypes;1, 2, 3, 4: BB genotypes; M, Marker DL2000. 图3 豫西脂尾羊的的GH基因PvuⅡ位点多态性Fig.3 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Yuxi fat-tailed sheep

6、7、8，AB基因型；1、2、3、4、5，BB基因型；M，Marker DL2000。6, 7, 8: AB genotypes; 1, 2, 3, 4, 5: BB genotypes; M, Marker DL2000.图4 湖羊的GH基因PvuⅡ位点多态性Fig.4 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Hu sheep

2、3、4，AB基因型；1、5、6、7、8，BB基因型；M，Marker DL2000。2, 3, 4: AB genotypes; 1, 5, 6, 7, 8: BB genotypes; M, Marker DL2000.图5 杜泊羊的GH基因PvuⅡ位点多态性Fig.5 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Dorper sheep

2.3 绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的群体遗传学分析

绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的群体遗传学分析结果见表1，可以看出，GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在大尾寒羊、小尾寒羊群体中AB基因型频率最高(0.786和0.750)，而在豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊群体中以BB基因型频率最高(0.576、0.529和0.541)。GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊群体中均以B等位基因频率为最高。GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊群体中的有效等位基因数为1.497～1.908，多态信息含量(PIC)为0.277～0.363，呈现为中度多态性(0.250.05)。

2.4 绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点与生长性状的关联分析

GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的多态性与绵羊生长性状的关联分析结果见表2，从表2可以看出，AB基因型的体质量、体长、胸宽、臀端高、管围、尻高、颈长上显著高于BB基因型(P<0.05)，GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点对其他性状无显著影响(P>0.05)。

3 讨论

由于生长激素基因在动物生长发育中有着重要的生理作用，对GH基因的研究就成为同类研究中的一个重要课题。Valinsky等[12]对绵羊GH基因第2内含子进行扩增，结果发现了2个等位基因。Bastos等[13]检测到葡萄牙绵羊品种中GH基因第4、5外显子的多态情况。任春环[14]通过PCR-SSCP的方法对4个绵羊品种的GH基因进行了多态性检测，结果表明，在所检测的第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子位点中，仅在第3内含子和第4外显子检测到SNP，其余位点均未检测到SNP。于洪川等[15]利用限制性片段长度多态性技术在不同滩羊群体中发现酶切位点并命名为AB、BB基因型。马丽娜[16]对GH基因在滩羊群体中多态性研究表明，GH基因在滩羊群体中具有多态性，出现AB、BB两种基因型，频率为0.362 3、0.637 7。本研究采用PCR-RFLP的方法在大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊5个绵羊群体中，对GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点只检测到了AB基因型和BB基因型，这与施安[11]、于洪川等[15]、马丽娜[16]等的研究结果相一致，与任春环[14]的研究结果不符。

表1 绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点的遗传多态性

Table1Genetic polymorphism ofPvuⅡ locus in intron Ⅱ ofGHgene in sheep

遗传多态性Genetic polymorphism频率Frequency大尾寒羊Large-tailedHan sheep小尾寒羊Small-tailedHan sheep豫西脂尾羊Yuxi fat-tailedsheep湖羊Hu sheep杜泊羊Dorper sheep基因型频率Genotype frequencyBB0.2140.2500.5760.5290.541AB0.7860.7500.4240.4710.459基因频率Gene frequencyA0.3930.3750.2120.2350.229B0.6070.6250.7880.7650.771杂合度Heterozygosity0.4760.4660.3320.3640.354多态信息含量Polymorphic information content0.3630.3580.2770.2980.291有效等位基因数Number of effective alleles1.9081.8761.4971.5751.547χ2值3.5717.4588.7275.8827.149P0.0590.0080.0030.0150.008

表2GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点与绵羊生长性状的关联分析

Table2Association ofPvuⅡ locus in intron Ⅱ ofGHgene with growth traits in sheep

性状TraitsAB基因型AB genotypeBB基因型BB genotype性状TraitsAB基因型AB genotypeBB基因型BB genotype体质量Body weight/kg52.32±6.97 a47.08±7.04 b背高Back height/cm 72.27±1.01 a69.09±1.03 a体高Body height/cm 69.55±9.60 a64.84±10.64 a胴体质量Carcass weight/kg 24.30±0.82 a21.25±1.49 a体长Body length/cm 70.94±7.32 a64.23±5.80 b尻高Rump height/cm 73.41±1.76 a64.92±3.58 b胸围Chest circumference/cm90.65±9.00 a91.23±9.84 a尻长Rump length/cm 23.72±1.02 a22.07±0.53 a胸宽Chest width/cm 29.47±4.48 a25.54±4.78 b头长Head length/cm 21.22±0.65 a19.15±0.88 a胸深Chest depth/cm 33.84±3.88 a33.00±4.49 a头深Head depth/cm 17.75±0.72 a16.23±0.75 a腰角宽Waist width/cm 29.21±11.98 a26.38±10.29 a颈长Neck length/cm 33.36±3.04 a27.69±2.14 b臀端宽Buttock width/cm 20.32±3.73 a20.15±3.44 a额宽Frontal width/cm 13.36±0.50 a12.46±0.64 a臀端高Buttock height/cm 68.89±6.87 a62.62±8.75 b腹围Abdominal circumference/cm 95.72±2.96 a99.53±3.05 a管围Cannon circumference/cm10.16±1.50 a9.07±1.12 b腿臀围Leg hip circumference/cm 92.05±2.31 a92.15±3.38 a

同行不同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

The values in the same row followed by different lower-case letters showed the significant difference (P<0.05).

胡沈荣等[17]分析了5个山羊品种GH基因，除了波尔山羊外，其他山羊品种均有多态性，且GH基因外显子5位点的基因频率分布与品种特性有关，外显子2与产羔多态性有显著关联(P<0.05)。张春香等[18]在南江黄羊生长激素第3外显子发现G/A突变与该品种6月龄和12月龄体质量和体高有影响。闵令江等[19]通过PCR扩增了山羊5′调控区序列，共得到5处突变位点，不同突变位点均与山羊体质量、体尺性状关联性较强。张建军等[20]以陇东山羊为研究对象，在GH基因外显子4区域发生碱基突变，与6月龄质量，周岁质量，胸围等指标显著相关。张浩等[21]在甘肃现代肉羊品种中GH外显子1上发现301 bp处的T/A突变造成AA、AB基因型，数据关联显示与肉羊体质量关联显著，且表现为杂合型明显高于纯合型。马丽娜[16]对GH基因在滩羊群体中多态性研究表明，GH基因不同基因型(AB和BB)与初生质量、二毛活质量、三月体质量和六月体质量差异均极显著(P<0.01)。多重比较结果显示，AB基因型个体各年龄阶段体重的最小二乘均值均极显著高于BB基因型(P<0.01)。王鹏[22]发现湖羊GH基因的外显子3位点的GH基因型和外显子4位点的LM基因型的初生质量、断奶质量和六月龄质量平均值均相对于另一个基因型。李文文等[23]通过对7个绵羊品种GH基因检测发现5′端调控区、第4外显子3′端区域均存在多态性，其中山谷型藏羊不同基因型个体间的体质量、体长、体高、胸围具有显著差异(P<0.05)。施安[11]研究表明，滩羊的GH基因内含子2的AB基因型初生质量、断奶质量、6月龄体质量显著高于BB基因型(P<0.05)。本研究表明，绵羊GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点AB基因型的体重显著高于BB基因型(P<0.05)，这与施安[11]和马丽娜[16]研究结果相符，此外本研究还表明，GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点对体长、胸宽、臀端高、管围、尻高、颈长等有显著影响(P<0.05)，这与闵令江等[19]和李文文等[23]的研究结果相似。可见，GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点可以作为绵羊生长性状的候选标记进行标记辅助选择。