犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位

张浩杰，刘 梅，李春燕，何 冉，兰景超，罗 娌，古小彬，谢 跃，杨光友，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都 610081)

犬恶丝虫病是由犬恶丝虫(Dirofilariaimmitis)引起的人兽共患寄生虫病，其成虫主要寄生于犬科和猫科动物的右心室及肺动脉内[1-2]。该病呈世界性分布，在热带、亚热带地区广泛流行，主要通过蚊媒传播，危害的宿主动物达30余种[1-2]。人可因被携带犬恶丝虫病原的蚊虫叮咬而感染，主要引起肺部出现病变，其次虫体在皮下、眼部、阴囊等处也有发现[3]。近年来，人感染该病的确诊例数呈逐年上升的趋势，已引起国际社会的高度重视[4]。目前，该病的诊断主要通过常规方法检测微丝蚴，但其灵敏度低，而免疫学诊断方法尚不完善；在预防中，由于尚无商业化的疫苗，目前主要采用药物预防，但化学药物存在耐药性及环境污染等问题[2]。

核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK，EC 2.7.4.6)是一种“管家酶”，其主要功能是催化腺苷三磷酸(nucleoside triphosphate，ATP)和核苷二磷酸(nucleoside diphosphate，NDP)之间的磷酸基团的转移反应以此来维持细胞NDP和NTP代谢平衡，对生物体的新陈代谢具有重要意义[5-6]。近年来研究发现，NDPK还可参与细胞内信号传导，调节细胞增殖、分化、发育和凋亡等[5, 7-8]。NDPK已于多种寄生虫中被发现，如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)、亚马孙利什曼原虫(Leishmaniaamazonensis)、马来丝虫(Brugiamalayi)、旋毛虫(Trichinellaspiralis)和捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)[5-22]，且认为NDPK可能是潜在的诊断抗原[11, 14, 22]和成为研发新的抗寄生虫药物的靶点[8-9, 13, 19]。但目前尚未见有关犬恶丝虫NDPK(Di-NDPK)的报道。

本研究从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选Di-NDPK基因[1]，完成克隆和原核表达，并分析其基本特征。对NDPK重组蛋白(rDi-NDPK)的反应原性进行了免疫印迹分析；用免疫组化的方法分析了Di-NDPK在犬恶丝虫雌虫和雄虫体内的分布情况，为Di-NDPK的功能研究、免疫诊断方法、疫苗和治疗药物等的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品和试验动物

犬恶丝虫的雌雄虫体均来源于自然感染犬恶丝虫死亡后的犬，解剖后采集的活虫用PBS清洗，进行形态学鉴定后储存于液氮中。将犬恶丝虫雌虫和雄虫包埋后，制作石蜡切片。2只健康新西兰大白兔，雌性，1.5～2.0 kg，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂

DH5α、BL21(DE3)、pMD19-T Vector购于TaKaRa公司；总RNA抽提试剂盒、TaqPCR MasterMix、质粒小量抽提试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker、Protein Marker、QuickCutTM限制性内切酶(EcoRⅠ/HindⅢ)、T4 DNA连接酶购于大连宝生物工程有限公司；HRP-标记羊抗兔IgG、HRP-标记兔抗犬IgG购于武汉博士德生物工程有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、镍螯合亲和层析柱、IgG纯化预装柱购于德国Qiagen公司；反转录试剂盒购于美国Thermo公司；IPTG、弗氏完全佐剂和不完全佐剂购于美国Sigma公司；FITC-标记羊抗兔IgG购于美国EarthOx公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选得到的Di-NDPKunigene 8 687(GenBank No.：JR904615.1)，ORF Finder工具分析Di-NDPK基因ORF框。利用BLAST对测序得到的目的片段序列进行检索，确认扩增得到的是NDPK基因。将该基因序列通过Clustal W软件与其他已报道的NDPK基因比对，用MEGA 5.1软件分别进行序列相似性分析和构建NJ(neighbor-joining)树。

1.2.2Di-NDPK基因的扩增、克隆

根据GenBank中筛选的序列(GenBank No.：JR904615.1)，用Primer premiere 5.0进行引物的设计，上游引物：F，5′-CCGGAATTCATGTCAGCTACAAAGGAACGAACATTTA-3′；下游引物：R，5′-CCCAAGCTTCTATTCATACACCCAAGTAATTGTTGCTG-3′(下划线序列分别含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点)，采用RT-PCR方法从犬恶丝虫总RNA中扩增Di-NDPK基因的ORF框。按照RNA抽提试剂盒指示提取犬恶丝虫总RNA，按反转录试剂盒合成cDNA，再进行PCR扩增。PCR反应体系(10 μL)：预染PCR Mixture 5 μL，灭菌水3.5 μL，上下游引物及cDNA各0.5 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58.5 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测是否有目的片段大小的条带，接着用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的产物，构建pMD19-T-NDPK及pET-32a-NDPK重组质粒，将菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 rDi-NDPK的表达和纯化

将测序正确的菌接种于LB液体培养基中(含AMP)，37 ℃环境下培养，至菌液在紫外分光光度计下D值达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，继续诱导培养6 h后，12 000 r·min-1离心收集菌体，经12%SDS-PAGE电泳检测，确定rDi-NDPK是否表达，并同时优化rDi-NDPK基因的原核表达条件。rDi-NDPK在最佳表达条件下大量表达后，经过镍螯合亲和层析纯化蛋白，最后用NanoDropTM One超微量紫外分光光度计测定纯化后蛋白的浓度。

1.2.4 rDi-NDPK的Western blotting分析

rDi-NDPK经12%SDS-PAGE分离，通过半干式转移到硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉(5%)室温封闭2 h后，加入一抗(犬恶丝虫阳性血清，1∶100)，在4 ℃条件下孵育过夜；经TBST洗涤4次后，加入二抗(HRP-标记兔抗犬IgG，1∶2 000)室温孵育2 h，再用TBST洗涤4次，经二氨基联苯胺(DAB)显色后，超纯水终止反应。

1.2.5 间接免疫荧光染色

用4%多聚甲醛固定犬恶丝虫雄虫和雌虫成虫，接着用石蜡包埋后制成切片(每片4 μm)，37 ℃晾干后，4 ℃保存。试验前，于60 ℃环境下烘1.0～1.5 h，再依次按二甲苯Ⅰ(7 min)、二甲苯Ⅱ(7 min)、100%乙醇Ⅰ(3 min)、100%乙醇Ⅱ(3 min)、95%乙醇(3 min)、85%乙醇(3 min)、75%乙醇(3 min)、双蒸水(8 min)进行脱蜡和水化。于95～100 ℃柠檬酸缓冲液中进行抗原的热修复后，用PBS洗涤3次；于组织上滴加3%H2O2进行抗原氧化(20 min)，用PBS洗涤3次；于组织上滴加5%BSA进行封闭(60 min)，用PBS洗涤3次；于组织上滴加兔NDPK-IgG(1∶100)，湿盒中4 ℃孵育过夜；用PBS洗涤3次，滴加FITC标记的羊抗兔IgG(0.1%伊文氏蓝1∶100稀释)，湿盒中37 ℃避光孵育1 h后使用PBS洗涤3次，再滴加适量甘油缓冲液封片，并在荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.2.6 间接ELISA的建立和评估

通过标准棋盘滴定法测定rDi-NDPK与血清反应的ELISA最佳稀释浓度。96孔板中包被抗原浓度10 μg·孔-1，4 ℃过夜。用PBST反复洗涤3次，加入5%的脱脂奶粉，37 ℃封闭1.5 h后反复洗涤3次。分别加入犬阳性血清和犬阴性血清，37 ℃孵育1 h后反复洗涤3次。随后加入HRP标记的羊抗犬二抗孵育1 h。反复洗涤后，每孔加入100 μL可溶性TMB显色底物进行显色，并以2 mol·L-1的H2SO4终止显色，于酶标仪上测定吸光值(λ=450 nm)。测定24份犬恶丝虫病阴性血清的D450，按照计算方法，临界值=平均值+3SD。

用建立的ELISA方法分别对8份细粒棘球蚴病阳性血清，2份细颈囊尾蚴病阳性血清，8份犬钩虫病阳性血清，18份犬弓首蛔虫病阳性血清进行检测，检测其交叉反应性。

以rDi-NDPK建立的ELISA方法，对24份犬恶丝虫病阳性血清进行检测，结合临界值，判定该方法的可靠性。特异性=真阴性血清数/(真阴性血清数+假阳性血清数)×100%，敏感性=真阳性血清数/(真阳性血清数+假阴性血清数)×100%，总体符合率=(真阳性血清数+真阴性血清数)/(真阳性血清数+假阳性血清数+真阴性血清数+假阴性血清数)×100%。检测所有血清的批间变异和批内变异的变异系数(CV)，即标准方差与平均值之比。每个被检测样品在不同的96孔板上分别检测3次，计算批间CV，在每个板内设3个重复，计算批内CV。

2 结果与分析

2.1 Di-NDPK基因的生物信息学分析

2.1.1 Di-NDPK蛋白的理化性质预测

经ORF Finder工具分析预测，Di-NDPK的ORF框长为462 bp，其中A、T、C、G含量分别为33.77%、27.27%、16.45%、22.51%，G+C含量为38.96%，A+T含量为61.04%。Protparam分析结果显示，Di-NDPK基因序列编码153个氨基酸，蛋白质的分子式C782H1232N212O221S9，相对分子量约45.7 ku。蛋白质不稳定系数及亲水性平均数分别为35.94和-0.277，因此，预测Di-NDPK是稳定的可溶性蛋白。对Di-NDPK的信号肽切割位点和跨膜区进行预测，结果显示无信号肽和跨膜区。预测Di-NDPK的B抗原表位结果显示，Di-NDPK的抗原表位主要集中在1-4、91-93、96-106、110-112、122-127位氨基酸。Predictprotein预测Di-NDPK蛋白的二级结构显示，该蛋白中α-螺旋(H)占39.87%，β-折叠(E)占18.30%，环状结构(L)占41.83%。

2.1.2 Di-NDPK蛋白的氨基酸序列相似性分析及系统发育树构建

对Di-NDPK基因的氨基酸序列在NCBI中通过BlastP在线搜索，并通过DNAMAN进行序列比对，比对结果如图1，结果发现，Di-NDPK氨基酸序列与罗阿丝虫(Loaloa)(登录号：XP_003139722)、马来丝虫(登录号：P48817)、犬弓首蛔虫(Toxocaracanis)(登录号：KHN88613)、有齿食道口线虫(Oesophagostomumdentatum)(登录号：KHJ94439)、鼠类圆线虫(Strongyloidesratti)(登录号：CEF65937)、美洲板口线虫(Necatoramericanus)(登录号：ETN73053)、十二指肠钩口线虫(Ancylostomaduodenale)(登录号：KIH60906)、锡兰钩口线虫(Ancylostomaceylanicum)(登录号：EPB68610)的NDPK或NDPKa氨基酸序列相似性分别为92%、88%、82%、72%、71%、70%、71%、71%，且从图中可以看出这些物种有94个氨基酸较为保守。运用MEGA5.0软件构建NJ系统发育树(图2)，从树中可以看出，Di-NDPK与罗阿丝虫和马来丝虫的亲缘关系较近，聚为一个分支。

2.2 Di-NDPK基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

Di-NDPK基因的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，得到与预期结果一致的特异性条带(图3-A)。重组质粒pMD19-T-NDPK和pET32a(+)-NDPK经EcoRⅠ和HindⅢ Quick Cut酶进行双酶切鉴定，插入片段的大小与预期结果一致(图3-B、C)。酶切鉴定正确的质粒pET32a(+)-NDPK送去测序，测序正确的序列用于转入BL21(DE3)菌株中，进行诱导表达。

图1 犬恶丝虫和其他物种的NDPK多序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of NDPK in D. immitis and other species

图2 NDPK蛋白的系统发育树(NJ树)Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins (NJ tree)

M1和M2，DNA分子质量标准；A，Di-NDPK的PCR产物；B，pMD19-T-NDPK的双酶切鉴定；C，pET32a(+)-NDPK的双酶切鉴定。M1， DL2000; M2， DL7000; A， PCR products of Di-NDPK; B， Identification of recombinant plasmid pMD19-T-NDPK by restriction endonucleases digestion; C， Identification of recombinant plasmid pET32a(+)-NDPK by restriction endonucleases digestion.图3 Di-NDPK基因的RT-PCR产物及重组质粒的酶切鉴定Fig.3 PCR products of Di-NDPK gene and plasmid by restriction endonucleases digestion

M，蛋白质分子质量标准；A，rDi-NDPK蛋白的表达，1，经IPTG诱导的含有pET32a(+)-NDPK的细菌；2、3，未经IPTG诱导的含有pET32a(+)-NDPK的细菌；4，经IPTG诱导的含有pET32a(+)的细菌。B，rDi-NDPK蛋白的纯化及免疫印迹，1，纯化后的rDi-NDPK；2，rDi-NDPK的免疫印迹。M， Protein marker; A， The expression of rDi-NDPK， 1， pET32a(+)-NDPK induced by IPTG; 2， 3， pET32a(+)-NDPK without IPTG induction; 4， pET32a(+) induced by IPTG; B， Purification of rDi-NDPK and Western blotting analysis， 1， Purified rDi-NDPK; 2， Western blotting analysis of rDi-NDPK.图4 rDi-NDPK的表达、纯化及免疫印迹分析Fig.4 The expression and purification of recombinant protein NDPK and Western blotting analysis

2.3 rDi-NDPK的表达、纯化及免疫印迹

经过条件优化显示，温度37 ℃，时间6 h，IPTG浓度为1.0 mmol·L-1是rDi-NDPK原核表达的最佳条件。rDi-NDPK经12%SDS-PAGE电泳，得到约35 ku的蛋白，与预期条带大小相同(图4-A)。原核表达的重组菌，超声破碎后经可溶性分析，该蛋白以上清的形式存在。经镍柱亲和层析柱纯化后的rDi-NDPK条带单一，显示纯度较好(图4-B)。免疫印迹分析，显示rDi-NDPK能与自然感染犬恶丝虫的犬阳性血清特异性结合，证明rDi-NDPK具有良好的反应原性(图4-B)。

2.4 Di-NDPK的免疫荧光定位

间接免疫荧光显示，Di-NDPK主要分布于雌性犬恶丝虫成虫的肠上皮细胞和肠腔，尤其在肠上皮细胞中大量分布，且分泌至肠腔中，在侧索有少量分布(图5-A、B)。Di-NDPK在雄性犬恶丝虫成虫的侧索、肌肉细胞和肠腔均广泛分布(图5-C、D)。

2.5 ELISA

间接ELISA结果显示，最佳血清稀释度为1∶20，最佳抗原包被浓度为0.58 μg·孔-1。在最佳血清稀释度和抗原包被浓度条件下，临界值为0.498。用建立的间接ELISA方法检测24份犬恶丝虫阳性血清，结果显示，16份阳性血清D值>临界值，8份阳性血清D值<临界值，敏感性为66.7%(图6-A)。但与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应，特异性为38.9%(图6-B)。批内重复性试验结果显示，批内平均变异系数为1.5%，批间重复性试验结果显示，批间平均变异系数为6.9%。批内和批间变异系数均小于10%，证明该方法具有良好的重复性。

A，雌虫阳性；B，雌虫阴性对照；C，雄虫阳性；D，雄虫阴性对照；HY，侧索；I，肠；TE，睾丸；PS，假体腔；MU，肌肉；UT，子宫；DE，胚胎。A， Female positive; B， Female negative control; C， Female positive; D， Female negative control; I， Intestines; PS， Pseudocoelom; UT， Uterus; MU， Muscle; HY， Hypodermis.图5 雌性犬恶丝虫成虫横切面Di-NDPK蛋白的间接免疫荧光定位Fig.5 Tissue localization of adult female and male D. immitis NDPK protein detected by indirect immunofluorescence

A，ELISA临床试验分析；B，ELISA交叉反应试验分析。实线代表cut-off值0.498。A， Clinical trial of the iELISA; B， The cross-reaction of the iELISA. The bold horizontal line indicates the cut-off value， which was 0.498.图6 重组Di-NDPK间接ELISA分析Fig.6 Indirect ELISA using rDi-NDPK as the antigen

3 讨论

NDPK存在于多种生物物种，在进化过程中高度保守[7, 18]。Di-NDPK的氨基酸序列与罗阿丝虫等不同线虫物种的NDPK氨基酸序列相似性高达70%以上。同时，对Di-NDPK蛋白的二级结构预测发现，该蛋白含有一个细胞黏附序列，即RGD序列(aa106-108)，氨基酸相似性比较分析发现，该序列与其他寄生虫的氨基酸序列完全一致。此外，Di-NDPK蛋白还存在一个核苷二磷酸激酶活性位点(aa116-124)，仅与马来丝虫的同源氨基酸序列位点有1个氨基酸差异，与普遍公认的NDP磷酸化序列(HGSDSV)也非常一致。其次，RGD序列紧密靠近NDPK活性位点，有可能RGD序列的Arg(R)残基在底物结合到活性位点裂口的位置中扮演着重要作用。Di-NDPK的C-端残基是YE，几种线虫的氨基酸相似性分析发现，这几种线虫的C-端残基也都是YE，非常保守，与大多数的NDPK以Y、YE、YET残基结尾较一致，与报道的恶性疟原虫的C-端残基ICS不同，这些残基对于NDPK的二聚是非常重要的[5, 8]。此外，由于Di-NDPK氨基酸序列中存在Lys12，与人类的Lys12一致，所以Di-NDPK可能有与DNA结合的活性[5]。

免疫印迹分析发现，rDi-NDPK能够被自然感染犬恶丝虫的犬阳性血清所识别，提示阳性血清中具有同Di-NDPK特异性结合的抗体，同时说明rDi-NDPK具有良好的反应原性。在对马来丝虫NDPK研究中也发现，人携带马来丝虫的慢性无症状的患者血清中NDPK特殊的IgG能被检测出[8]。其次，NDPK在利什曼原虫、旋毛虫和捻转血矛线虫中已被确认存在其分泌蛋白产物中[11, 14, 16, 22]。作为分泌蛋白，通常暴露在宿主的免疫系统下，具有潜在的免疫学诊断价值。

犬恶丝虫病的常规诊断方法主要有病原检测，血清学检测和分子生物学检测[23]。目前，血清学检测是最常用的检测方法，分为抗原检测和抗体检测。抗原检测的假阴性结果常见于轻微感染、雌虫尚未成熟、仅感染雄虫等情况；抗体检测较抗原检测的优势在于，不论雌虫还是雄虫都能检测出来。宿主感染犬恶丝虫2个月后，幼虫刺激机体所产生的免疫反应就能被检测出来，抗体检测比抗原检测能更早地检测出犬恶丝虫，适用于犬恶丝虫病的早期检测[24]。目前，已报道的重组抗原DGK、MTFP具有较高的敏感性和特异性，适合用于犬恶丝虫病的诊断，同时，一些敏感性和特异性低的重组抗原，不适合作为诊断抗原[25-26]。本实验结果显示，rDi-NDPK敏感性为66.7%，特异性为38.9%，同时与犬细粒棘球蚴病血清、犬细颈囊尾蚴病血清、犬钩虫病血清和犬弓首蛔虫病血清的交叉反应。因此，rDi-NDPK蛋白不适合用于犬恶丝虫病的诊断。

研究发现，嗜血性寄生虫(如犬恶丝虫)肠上皮细胞的“隐藏抗原”能被宿主的免疫应答机制所识别，但它们通常不会暴露在宿主的免疫系统之下，因此，与分泌排泄抗原或传统的暴露在虫体表面的抗原相比，肠上皮细胞的“隐藏抗原”更适合做寄生虫的重组蛋白疫苗[27]。对Di-NDPK的免疫荧光定位研究发现，NDPK蛋白分布在侧索及肠上皮细胞和肠腔中，尤其在肠上皮细胞和肠腔中有大量的NDPK存在，说明NDPK可能主要分泌到犬恶丝虫的肠腔中，是其肠上皮细胞的“隐藏抗原”。其次，对兔抗rDi-NDPK抗体检测显示，rDi-NDPK具有良好的免疫原性，与马来丝虫和利什曼原虫报道的结果一致[8, 16]。因此，我们推测Di-NDPK可能是一个犬恶丝虫的候选疫苗基因，其免疫保护效果还有待进一步的验证。