血必净对兔急性肺损伤的早期保护作用及其机制研究

贺慧博 郝建 杨炜

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory disease syndrome，ARDS）是同一疾病过程的两个阶段，是指由各种肺内、肺外因素导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭，是临床常见危重症，病死率高达30%~50%[1]。ALI的发病本质是各种肺内、肺外致病因素引起肺部炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等）反应，大量炎症细胞因子（TNF-α、IL-1等）在肺中激活、聚集，异常升高的细胞因子与过度激活的免疫细胞、中性粒细胞、巨噬细胞之间形成正反馈机制，最终造成肺组织中炎症反应失控，肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞弥漫性损伤，大量渗出液聚集使气道阻塞，临床表现为急性非心源性肺水肿和顽固性低氧血症（PaO2/FiO2≤300mmHg）[2-3]。爆炸伤是 ALI的常见致病因素，无论是战争，还是生活、生产过程中，爆炸事故频发。爆炸产生的冲击波、高温、有毒有害气体等因素极易造成肺实质、肺间质的损伤，进而引起多种炎症细胞的反应、炎性介质释放、血管通透性改变等，最终造成ALI。目前爆炸制备家兔急性肺损伤实验模型方法成熟，且能很好复制ALI状态[4-5]。血必净是红花、丹参、赤芍、当归、川芎等提取物制成的中药复合制剂，主要成分是红花黄色素A，临床主要用于因感染、烧伤、创伤等引起的局部或全身炎症反应及多器官功能衰竭综合征的早期治疗。研究表明，血必净能够有效地拮抗内毒素、抑制TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8 等内源性炎性介质的过度释放，增强机体免疫，改善微循环等[6]。本研究通过爆炸制备家兔急性肺损伤模型，探讨血必净对抑制ALI早期急性炎症反应的作用机制，为临床ALI的治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 药物、试剂与仪器 血必净注射液（10ml/支）购自天津红日药业；地塞米松磷酸钠注射液（5mg/支）购自山西晋新双鹤药业；ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；核转录因子NF-κB Western blot试剂盒（148G3026）、基质金属蛋白酶（MMP-9）Western blot试剂盒（217K2185）均购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒（00145205）购自美国Thermo公司；ActinTA-09（150527）、山羊抗小鼠IgG ZB2305（109145）、山羊抗兔IgG ZB2301（109525）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；引物合成设备及Trizol（14105）购自美国Invitrogen公司。

1.2 实验动物 普通清洁级家兔40只，雌雄各半，体重（2.25±0.25）kg，购于安徽长临河医药科技有限公司，合格证号 scxk（皖）2006-002。

1.3 方法

1.3.1 分组 将40只家兔按随机数字表法分为血必净低剂量（L）组、高剂量（H）组、地塞米松（D）组、氯化钠注射液对照（N）组及ALI模型（A）组5组，每组8只。除了N组外其他组均进行ALI模型制备，造模成功后L、H组分别给予10、20ml/kg的血必净注射液；D组给予0.5ml/kg地塞米松注射液（1mg/ml）；N、A组给予10ml/kg氯化钠注射液。各组于实验前禁食12h，禁水4h。

1.3.2 ALI模型制备 依据相关文献，采用空中爆炸法制备ALI模型[4-5]。将家兔胸部脱毛，双耳备皮、塞入棉球，固定于支架，置于钢质保护箱（保护箱于家兔胸部位置有一开口，大小可调，控制实验时暴露部分仅为家兔胸部，其余身体部位均在箱体内）。将钢制保护箱放置于空中爆炸场并固定。爆炸装置为35g球形工业炸药，药心与家兔胸部中心点同一水平，水平距离35cm，引爆装置为8号雷管。在距离炸药药心水平线35cm的另一侧安置空中压力传感器，用于监测点处压力时程曲线，爆炸程序由专业人员操作。爆炸后，立即对爆炸场内抽风排气，迅速转移实验样本于安全通风环境下，进行简单处理（清创缝合伤口，保持呼吸道通畅等），观察并记录其生命体征。造模成功后，各组家兔给予相应药物处理，24h后，家兔麻醉、抽血、取材。本研究中涉及家兔相关处置均通过安徽医科大学伦理委员会批准。

1.3.3 检测指标

1.3.3.1 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量测定 采用ELISA法。取家兔耳缘静脉血，常温3 000r/min离心10min，取上清液于-80℃液氮罐保存。ELISA法检测按说明书操作。

1.3.3.2 肺湿干重比（W/D） 麻醉后取右肺中叶肺组织2.5g左右，吸干表面杂质，称取湿重后，再置于80℃烘箱72h至烘干，称取干重，计算比值。

1.3.3.3 肺组织NF-κB、MMP-9蛋白表达水平测定 采用Western blot法。麻醉后取右肺上叶部分肺组织100mg左右，称重，剪碎，液氮研磨，加入RIPA细胞裂解液1ml，12 000r/min离心10min，取上清液，即含有组织总蛋白，采用Western blot法进行测定，相关方法步骤严格参照说明书进行。

1.3.3.4 肺组织NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平测定采用RT-PCR法。取右肺上叶肺组织样本，称重，剪碎，液氮研磨，加入1ml Trizol匀浆于4℃、12 000r/min离心10min。采用Trizol法获取总RNA，逆转录成cDNA,再行荧光定量PCR反应。实验采用相对定量研究法法进行分析，分析采取的指标为：2-ΔΔCt。实验使用的上游引物序列为：5′-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3′，下游引物为：5′-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3′。相关方法步骤严格参照说明书进行。

1.3.3.5 肺组织病理学观察 肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片4~5μm厚，HE染色，光镜下观察其病理改变。并采用Smith肺损伤病理评分[7]进行评价：没有损伤为0分；轻度损伤、间质水肿和局限性坏死、病变范围＜25%为1分；中度损伤、广泛的肺脏细胞肿胀和坏死、或病变范围25%～50%为2分；严重损伤、有毛细血管内皮肿胀、细胞间隙增宽、大量炎性细胞浸润和肺脏萎缩的坏死，或病变范围51%～75%为3分；极严重的损伤、弥漫性血管损伤、出血和肺脏坏死，或病变范围76%～100%为4分。累加每组家兔的分数，并计算出平均分值，分值越高提示该组家兔炎症病变程度越重。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5 组家兔血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量及肺 W/D 值比较 L、H、D、A 组 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及W/D值均比N组高（均P＜0.05）；L、H、D组TNF-α、IL-1β、IL-6及W/D值均比A组低，其中H组降低最明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而L、H 、D组IL-10含量均高于A组，其中H组升高明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

2.2 5组家兔肺组织NF-κB、MMP-9蛋白表达水平比较 肺组织NF-κB、MMP-9蛋白表达水平以A组最高，而L、D、H组依次降低，H组降低最显著，见图1。

2.3 5组家兔肺组织NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平的比较 L、H、D、A 组 NF-κB、MMP-9 mRNA 的表达水平均比N组高（均P＜0.05），L、H、D组则均比A组低，其中以H组降低最明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 2、表 2。

2.4 5组家兔肺组织病理变化 N组未见明显改变，其余各组肉眼可见肺体积变大，表面散在瘀斑，部分组织切面可见红色实样变，伴有泡沫样渗出。光镜下见肺泡壁充血，间质水肿，肺泡腔相对狭窄，伴炎症细胞浸润，可见出血、渗出等。L、H、D组较A组改变相对较轻，其炎性浸润等较少、且肺泡壁充血相对改善，其中以H组改善最明显，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3、图3。

3 讨论

实验前，各组家兔呼吸、心率等生命体征均平稳，无烦躁不安、意识异常等情况。爆炸致伤后，各组家兔呼吸浅快，活动后出现呼吸窘迫、点头呼吸等现象，口唇等皮肤黏膜相继出现发绀，口鼻分泌物增多，肺部听诊有明显湿啰音，甚至少数家兔出现短暂昏迷，提示出现呼吸功能不全。爆炸致伤后，肉眼可见家兔肺体积变大，表面散在瘀斑，部分组织切面可见红色实样变，切面可伴有泡沫样渗出。光镜下见肺泡壁充血，间质水肿，肺泡腔相对狭窄，伴炎症细胞浸润，可见出血、渗出等。爆炸损伤肺实质、肺间质，引起多种炎症细胞的反应、炎性介质释放、血管通透性改变，肺顺应性改变等，进而引起肺通气血流比例失调，出现呼吸困难等现象。L、D、H、A组均出现以上现象，但以H组改变相对最轻。本实验显示，爆炸后各组家兔呼吸加快、呼吸困难、烦躁不安，口鼻分泌物增多，昏迷，肺部啰音等，W/D比值明显升高，血气PaO2/FiO2≤300mmHg，且肺病理学改变符合ALI病理变化标准，提示造模成功、有效[8]。

ALI发病机制复杂，肺或全身炎症反应失控被认为是ALI/ARDS的主要发病机制。爆炸伤后，炎症介质尤其是TNF-α、IL-1、IL-6等“早期反应细胞因子”大量释放，从而诱发炎症级联反应。其中促炎细胞因子（主要包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）和抗炎细胞因子（主要有IL-4、IL-10、IL-1受体拮抗剂等）失衡在发病过程中起重要作用[9]。IL-1β在ALI发病中能诱导中性粒细胞和单核/巨噬细胞趋化，产生多种趋化因子如IL-8、MCP-1等，最终导致炎症浸润。而TNF-α能诱导白细胞迁移、粒细胞脱颗粒、肺内皮细胞活化、和毛细血管渗透性增加，促进水肿液形成，影响肺泡气体交换，造成低氧血症等；此外，TNF-α还与其他细胞因子形成作用网络促进ALI的发生、发展[10]。而IL-10是一个以免疫抑制为主的多向免疫调节因子，其主要生物活性表现为直接抑制炎症细胞活化，可抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF 等表达[11]。实验结果显示，造模成功后，L、H、D、A组血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表达均比 N 组高；A组TNF-α、IL-1β、IL-6表达均高于 L、D、H 组；而 A 组IL-10的表达低于L、D、H组；其中均以H组变化最明显。提示TNF-α、IL-1β、IL-6是ALI重要的促炎介质，而IL-10在体内发挥着重要的抗炎作用，且血必净、地塞米松对肺损伤都有保护作用，但以H组最明显。

表1 5组家兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量及肺W/D值比较

图1 5组家兔NF-κB、MMP-9蛋白表达电泳图

图 2 5组家兔 NF-κB、MMP-9 mRNA 的扩增、熔解曲线（a：NF-κB mRNA 的扩增曲线；b：NF-κB mRNA 的熔解曲线；c：MMP-9 mRNA的扩增曲线；d:MMP-9 mRNA的熔解曲线）

表2 5组家兔肺组织NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平的比较

表3 5组家兔肺组织病理评分（分）

图3 5组家兔组织病理学结果（a:N组；b:A组；c:L组；d:D组；e:H组；HE染色，×400）

NF-κB是参与调控机体多种免疫、炎症反应和应激的早期快反应基因表达的一种核蛋白因子。爆炸致伤家兔后，激活NF-κB，核易位增加，启动TNF-α等表达，释放的TNF-α等与创伤一起进一步易化NF-κB的活化[12]，基于以上观点NF-κB可能是失控炎症基因表达的调控点。本实验结果显示，造模后L、D、H组较A组NF-κB表达量降低，以H组变化最明显。因此推测血必净可能有抑制NF-κB表达、减轻炎症反应的作用。MMP-9是MMPs家族中的一员，研究表明，MMP-9在正常肺组织细胞中只产生极微量的MMP-9，一旦发生ALI，MMP-9表达量急剧上升[13]。且MMP-9与肺损伤程度正相关[14]。且MMP-9对多种促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）发挥正反馈作用。因此有学者指出MMP-9是影响ALI发生、发展的重要机制之一，抑制MMP-9的表达活性有望成为救治ALI的新途径。本实验结果同样提示，造模后L、D、H组MMP-9表达量均较A组有不同程度降低，且降低程度与病理改变趋势基本一致，且以H组变化最显著，与相关研究结果类似，即MMP-9可以一定程度提示肺损伤程度。

血必净是红花、丹参、赤芍、当归、川芎等提取物制成的中药复合制剂，主要有效成分为红花黄色素A等物质。研究表明血必净注射液对创伤、感染等导致的ALI模型有较好的功效，能有效拮抗内源性炎症介质的作用，抑制炎症因子的产生及作用[6，15]。临床主要用于因感染、烧伤、创伤等引起的局部或全身炎症反应及引起的多器官功能衰竭综合征的早期治疗。本次实验结果显示，ALI模型，L、D、H、A 组 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表达量及W/D均比N组高。经血必净治疗后，L、H 组 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 表达量及W/D均比A组低，IL-10表达量则均比A组高，其中均以H组改变最显著。且肺病理切片显示血必净治疗后肺组织损伤明显减轻。提示血必净注射液可以通过下调 MMP-9、NF-κB 的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6活性，增强IL-10活性，从而抑制炎症反应，抑制细胞早期急性炎症反应，阻断细胞因子级联反应，从而起到对家兔ALI的保护作用。

综上所述，爆炸致伤家兔可以成功复制ALI模型。血必净注射液可以通过下调MMP-9、NF-κB的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6 活性，增强 IL-10 活性，抑制细胞早期急性炎症反应，从而发挥其对爆炸致家兔ALI的保护作用。