FLT3-ITD基因阳性急性髓系白血病的免疫表型及临床特征研究

吴国才，杨志刚，李庆华，马境志

(1.广东省湛江中心人民医院血液风湿科 524000；2.广东医科大学附属医院血液内科，广东湛江 524000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人最常见的急性白血病，患病率在年轻人群中为2/10万人～3/10万人，老年群体则有所上升，为13/10万人～15/10万人[1-2]。随着近年医学研究及技术的进步，给予患者规范化化疗及采取造血干细胞移植等手段提高了临床治愈率，相关数据显示治愈最高可达50%以上[3-4]。相关文献提示AML的整个发生、发展是一个多因素参与过程，而在这个过程中，酪氨酸激酶受体通路起着一定的作用，研究显示酪氨酸激酶受体通路会促进细胞的分化[5]。有研究发现，FMS样酪氨酸激酶3内部串联重复序列(FMS-like tyrosine kinease 3-internal tandem duplication，FLT3-ITD)与AML的治疗反应及预后有密切联系[6]，而当前对于该类型的AML患者免疫表型特点及临床特征报道较少，作者选择广东医科大学附属医院血液内科2016年5月至2018年11月收治的140例AML患者，分析FLT3-ITD阳性与阴性患者的免疫表型及实验室相关指标变化，以为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择广东医科大学附属医院血液内科2016年5月至2018年11月收治的140例AML患者，其中男86例，女54例；年龄19～83岁，平均(47.73±3.58)岁。140例AML患者中FLT3-ITD阳性25例(阳性组)，其中男15例，女10例；年龄18～82岁，平均(46.33±2.87)岁。FLT3-ITD阴性患者115例(阴性组)，其中男71例，女44例；年龄为19～83岁，平均(47.73±3.58)岁。依据法国、美国和英国协作组(FAB)标准及世界卫生组织(WHO)标准将140例AML患者进行分型：M245例，M436例，M512例，M613例，余下34例形态不能分类。纳入标准：(1)均符合AML临床诊断标准[7]；(2)所有纳入者均通过骨髓细胞形态学、细胞免疫学、染色体、基因突变等确诊；(3)完全符合WHO、FAB相关标准；排除了急性早幼粒细胞白血病(APL)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS)等疾病转化为的AML及治疗相关白血病。

1.2方法

1.2.1FLT3-ITD基因检测 在患者入院次日，抽取晨起空腹骨髓标本5 mL，分离并取其上悬液，其中包含有1.0×107单个核细胞，应用DNA提取试剂盒(美国Pro-mega公司提供)提取受检标本的DNA，对标本DNA的吸光度进行测定，并调整标本DNA水平为50 ng/mL，随后进行PCR扩增处理，所用引物设计参考文献[7]，使用含有Gold View核酸染色剂的2%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析后，采用TanonMP系统予以摄像并分析处理，若出现重叠329 bp条带，则可以确定为FLT3-ITD突变阳性。

1.2.2免疫表型的检测 取受检者2 mL肝素抗凝骨髓液，随后给予骨髓标记染色处理，可应用单克隆抗体(荧光素标记)进行染色，并应用散点图设门法流式细胞术(CD45/SSC双参数)检测细胞免疫表型，分别检测淋系和髓系抗原。

1.2.3化疗方案 主要用药包括高三尖杉酯碱、蒽环类药物及阿糖胞苷等，若患者年龄超过60岁则在诱导治疗时，注意药物剂量的使用。临床常备化疗方案包括去甲氧柔红霉素、柔红霉素与高三尖杉酯碱分别联合阿糖胞苷，对于部分呈低增生性白血病患者或者高龄患者，则选择阿克拉霉素联合阿糖胞苷与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。对于FLT3-ITD基因阳性或者阴性的治疗具体依据患者情况随机选用。

1.2.4疗效评价 依据血液病学诊断与疗效标准[8]，完全缓解(CR)：白血病的症状体征消失，血象中血红蛋白(Hb)≥100 g/L(男)或90 g/L(女及儿童)，中性粒细胞绝对值(ANC)≥1.5×109g/L，血小板(PLT)≥100×109g/L，外周血无白血病细胞(LC)；骨髓象中原始粒细胞+早幼粒细胞(原始单核细胞+幼单核细胞或原始淋巴细胞+幼淋巴细胞)小于5%，红系及巨核系正常。部分缓解(PR)：骨髓原始细胞5%～20%；或临床、血象2项中1项未达CR标准者。

1.3统计学处理 数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计数资料以百分率描述，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组AML患者的LC免疫表型比较 本研究中共检测出CD7、CD13、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33、CD34、CD38、CD16、CD117、CD11c、CD56及CD64共14个抗原，其中CD7、CD33、CD56及CD117存在异常表达；与阴性组患者比较，阳性组患者CD117表达率明显降低，而CD7、CD33及CD56的表达率明显升高，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组AML患者的LC免疫表型比较[n(%)]

2.2两组AML患者的临床特点比较 初诊时，外周血白细胞计数(WBC)阳性组中17例患者(>50～100)×109/L，占比为68.00%，8例患者的外周血WBC>100×109/L，占比为32.00%；阳性组患者外周血WBC>100×109/L的比例明显高于阴性组AML患者，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。17例阳性组患者的骨髓LC>80%，占比为68.00%，明显高于阴性患者，两组患者比较差异有统计学意义(P<0.05)，而两组患者的Hb及PLT水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组AML患者相关指标比较[n(%)]

2.3两组AML患者的临床治疗效果比较 阳性组患者中，3例患者在化疗中死亡(死因为严重感染或出血并发症)，余下22例患者中，CR 6例(27.27%)；PR 3例(13.64%)；治疗总反应率为40.91%。阴性组患者中参与此次评价的共95例，CR 49例(51.58%)，PR 20例(21.05%)，治疗总反应率为72.63%(69/95)，阴性组患者的治疗总反应率明显高于阳性组患者，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组AML患者的临床治疗效果比较[n(%)]

3 讨 论

近年，相关研究证实在AML的发生及预后中，FLT3的相关基因突变类型发挥着重要作用。而在AML中，近膜区域的ITD突变是FLT3的最为常见的突变形式，国内相关文献报道显示，对于成人AML患者而言，FLT3-ITD的突变发生率最高为20.8%[8]，另外亦有研究及文献报道FLT3-ITD的突变发生率高达31%以上[9-10]。本研究结果显示在140例初诊AML患者中，25例发生了FLT3-ITD的突变，与国内其他文献报道结果相似[11-12]。FLT3-ITD的突变发生率文献报道存在差异可能与选择的样本量不同有关。

相关研究及报道提示，与FLT3-ITD突变阴性比较，FLT3-ITD突变阳性AML患者免疫细胞表型CD34与CD117均呈现低表达，而CD4、CD13、CD14、CD33及CD64的表达均较高[13]，本研究结果显示，与FLT3-ITD突变阴性比较，FLT3-ITD突变阳性AML患者CD7、CD33及CD56呈高表达而CD117呈低表达，与该研究报道相符，由此提示FLT3-ITD阳性AML患者LC有明显的免疫标记异常情况发生。

PORT等[14]的研究中，对AML患者中的核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变、FLT3-ITD突变、CD56阳性及高LC患者的完全缓解率、生存率进行了比较分析，结果表明FLT3-ITD突变患者与CD56阳性患者的无事件生存率较相应的阴性对照低，完全缓解率也相对较低，可见FLT3-ITD的突变及CD56的高表达与AML患者的预后较差有一定关联性。本研究针对性比较了FLT3-ITD阳性与FLT3-ITD阴性患者的细胞免疫表型，结果显示FLT3-ITD阳性患者的CD56呈高表达且明显高于FLT3-ITD阴性患者，由此提示FLT3-ITD阳性AML患者预后不佳可能与CD56的高表达有关。有研究显示，在部分AML患者中，LC表面出现了淋系抗原表达，其中CD7是淋系抗原中T淋巴细胞分化的重要标志且主要表达于外周T淋巴细胞及胸腺细胞中[15]，有研究显示，在AML患者中CD7的表达率为11.9%～33.5%，且FLT3-ITD突变AML患者的CD7呈高表达，证实AML患者的FLT3-ITD基因发生突变与CD7的高表达有直接关系[16]。本研究中，FLT3-ITD阴性患者的CD7表达较低，且明显低于FLT3-ITD阳性患者，再次证实AML患者的FLT3-ITD基因突变与CD7的高表达有直接相关性。有文献表明，FLT3-ITD阳性患者均有骨髓LC占比较高、外周血WBC高及完全缓解率较低的临床特征[17]。本研究结果显示，在初诊时，FLT3-ITD阳性AML患者外周WBC>100×109/L及骨髓LC>80%的占比均高于FLT3-ITD阴性患者，同时结果显示，FLT3-ITD阳性患者的治疗反应率明显低于FLT3-ITD阴性患者，可见FLT3-ITD基因突变在AML的整个发病及病情进展过程中起着重要作用，加强对FLT3-ITD的研究，对于了解患者预后状况有一定的意义和价值，同时可以指导临床制订合适的治疗方案。

综上所述，对AML患者FLT3-ITD基因型的免疫表型及临床实验指标进行分析，表明FLT3-ITD阳性AML患者呈现出特异免疫表达异常，临床实验室指标有特殊性，对AML患者的临床治疗及预后有极为重要的意义。