右美托咪定预处理对新生期吸入七氟醚大鼠青年及成年期海马神经元凋亡的影响

梁小丽，张洁，刘程曦，张超，徐珊，张益2,，朱昭琼

(1遵义医科大学附属医院，贵州遵义563000；2贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室；3遵义医科大学麻醉医学院；4遵义医科大学第二附属医院)

七氟醚因具有诱导苏醒快、对血流动力学影响较小等优点，在临床上常用于小儿麻醉。但是有研究显示，新生期重复吸入七氟醚可发生远期学习记忆能力下降，可能与七氟醚导致海马神经元凋亡有关[1]。因此，如何预防七氟醚吸入引起的海马神经元凋亡逐渐成为研究热点。右美托咪定(Dex)是一种α2肾上腺受体激动剂，具有安全性高、不良反应少等优点，同时，Dex还可显著改善吸入麻醉药如七氟醚等所引起的术后认知功能障碍[2]，但其是否可以减轻新生期吸入七氟醚后引起的远期海马神经元凋亡尚不明确。2017年1月～2018年12月，本研究观察了Dex预处理对新生期吸入七氟醚大鼠青年期及成年期海马神经元凋亡的影响，为临床预防或减轻七氟醚的大脑毒性作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料 健康7日龄SD雄性大鼠60只，体质量11～20 g，购于重庆第三军医大学实验动物中心。七氟醚(批号：65130704)购自山东鲁南制药公司，兔抗鼠激活型Caspase-3一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司，Fabius麻醉机及Va-mos气体监护仪购自德国Drager公司，低温高速离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司，电泳仪、湿转转膜仪、曝光仪购自美国Bio-Rad公司，正置荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 动物分组及干预方法 将60只健康7日龄SD雄性大鼠采用数字表法随机分为七氟醚组、Dex预处理组和空白对照组，每组20只。七氟醚组于出生后第7、14、21天腹腔注射3 mL/kg生理盐水，20 min后吸入2.6%七氟醚+运载气体(O21 L/min +空气1 L /min)4 h。Dex预处理组将Dex稀释为6.7 μg/mL，腹腔注射剂量为20 μg/kg，其余处理同七氟醚组。空白对照组采用相同的方法腹腔注射生理盐水并吸入运载气体4 h。实验期间将大鼠放置在自制的吸入麻醉箱中，箱底铺一薄层钠石灰，吸入过程中用自制水浴箱加热控制箱温在30～34 ℃，气体监测仪持续监测保证进气孔和出气孔七氟烷浓度一致。监测麻醉过程中的呼吸频率和皮肤色泽，若大鼠发生缺氧则予以排除。

1.3 海马神经元凋亡情况检测 采用TUNEL法。三组分别于青年期(37日龄)和成年期(97日龄)随机选取5只大鼠，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠，采用4%多聚甲醛PB液行心脏灌注，取整个脑组织，将其置于相同固定液中48 h。待组织固定后，行常规脱水、浸蜡、包埋，切片机行冠状连续切片，厚度4 μm。经乙醇脱蜡、水化、封片，严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作。于200倍光镜下随机观察并计数海马CA1区5个不重复视野棕褐色TUNEL阳性神经元数量，计算平均值。

1.4 海马组织激活型Caspase-3表达检测 采用Western blotting法。三组分别于青年期(37日龄)和成年期(97日龄)随机选取5只大鼠，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠，快速断头取脑，冰上分离海马组织。加入细胞裂解液，提取海马组织蛋白，BCA法进行蛋白定量。取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭。加入兔抗鼠激活型Caspase-3一抗(稀释比例1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(稀释比例1∶8 000)，常温孵育1 h后曝光成像。采用Image J软件检测蛋白条带灰度值，激活型Caspase-3蛋白相对表达量以激活型Caspase-3与内参蛋白β-actin灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 三组不同时期海马凋亡神经元数量比较 七氟醚组、Dex预处理组、空白对照组青年期海马凋亡神经元数分别为(1.6±1.5)、(23.6±6.7)、(3.6±1.1)个，成年期分别为(2.0±1.2)、(20.4±6.3)、(3.6±2.1)个；七氟醚组青年期和成年期海马凋亡神经元数量多于同期Dex预处理组和空白对照组(P均<0.01)，空白对照组与Dex预处理组同期组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。三组青年期与成年期海马凋亡神经元数量组内比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

注：箭头所指为TUNEL阳性细胞。

图1三组青年期和成年期海马组织细胞凋亡情况(TUNEL法)

2.2 三组不同时期海马组织激活型Caspase-3相对表达量比较 七氟醚组、Dex预处理组和空白对照组青年期海马组织激活型Caspase-3相对表达量比较分别为0.47±0.08、0.18±0.02、0.16±0.03，成年期分别为0.39±0.04、0.17±0.06、0.15±0.02；七氟醚组青年期和成年期海马组织激活型Caspase-3相对表达量均高于同期Dex预处理组和空白对照组(P均<0.01)，空白对照组与Dex预处理组同期组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。三组青年期与成年期海马组织激活型Caspase-3相对表达量组内比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 三组青年期和成年期海马组织激活型Caspase-3表达情况(Western blotting法)

3 讨论

七氟醚具有血气分配系数低、吸收清除较快、气道刺激性小等优点，常用于小儿麻醉的诱导与维持[3]。每天大量新生期患儿接受七氟醚麻醉，而新生期七氟醚暴露是否会引起患儿在学龄期和成年期学习记忆能力降低，是患儿父母乃至社会广泛关注的问题[4]。然而，由于临床研究观察周期较长，目前对于这一问题尚未得出确切结论[5]。大量动物实验显示，新生期重复七氟醚暴露可引起远期海马神经元凋亡，同时长期抑制海马神经元长时程增强(LTP)，导致动物幼年期和成年期学习记忆能力下降[6～8]。Caspase是一类存在于细胞质中的半胱氨酸特异性蛋白酶，其多种亚型在细胞凋亡过程中均发挥重要作用[9]。其中凋亡蛋白酶Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是多种凋亡途径的共同下游效应部分，其活化是凋亡进入不可逆阶段标志，激活后的Caspase-3可切割DNA依赖的蛋白激酶与聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，由此影响DNA的复制、转录和修复[10]。本研究结果显示，七氟醚组青年期和成年期海马凋亡神经元数量、激活型Caspase-3相对表达量均高于同期空白对照组；说明大鼠新生期重复七氟醚吸入后，在青年期和成年期时海马神经元凋亡增加，与之前报道的新生期重复七氟醚暴露可导致青年期和成年期突触的长时程和短时程可塑性损害一致[11]，而海马神经元凋亡可能是其功能发生改变的病理基础。

Dex可通过激活大脑内的α2肾上腺素能受体发挥镇静催眠作用，同时也有研究显示，Dex对吸入麻醉药如异氟醚所致神经毒性有显著的即时保护作用[12]。Dex的脑保护作用机制可能涉及PI3K/Akt通路：Dex预处理可恢复异氟醚导致的磷酸化Akt水平下调、Bad蛋白表达上调以及Bcl-xL/Bad比例下降，而应用PI3K抑制剂可部分消除Dex的神经保护作用[13]。此外，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族中的p38和c-jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂也可部分消除Dex的神经保护作用，说明Dex也可能通过这两条通路减轻异氟醚所致的新生期神经元凋亡[14]。Dex也可减轻七氟醚导致的发育期神经毒性作用。研究显示，Dex可通过下调Drp1蛋白和Bax蛋白表达、上调Bcl2表达，同时改善七氟醚导致的自噬和线粒体动力学异常，最终发挥神经保护作用[15]。然而，Dex是否可以减轻七氟醚的远期毒性作用目前尚不清楚。本研究结果显示，Dex预处理组青年期和成年期海马凋亡神经元数量、激活型Caspase-3相对表达量均低于同期七氟醚组，与空白对照组同期组间比较均无统计学差异；说明Dex预处理可有效减轻新生期大鼠吸入七氟醚的远期毒性作用。而对于这种长期的脑保护机制是否与既往报道的中短期保护机制相同，仍需进行更深入的研究。

综上所述，Dex预处理可显著减少新生期吸入七氟醚大鼠青年期和成年期海马神经元凋亡，由此减轻七氟醚的远期毒性作用，从而保护脑组织。Dex预处理的方法简便易行，可为临床上防治七氟醚对患儿学习记忆能力的长期影响提供新的思路。