miR-21靶向调控PDCD4在四逆汤减轻大鼠心肌细胞损伤中的意义

2019-09-23 03:49梁丽英刘欢张永琴陈炜陈晶
山东医药 2019年23期
关键词:含药阿霉素细胞系

梁丽英,刘欢,张永琴,陈炜,陈晶

(1广西中医药大学第一附属医院医学分子生物实验室,南宁530023;2广西中医药大学第一附属医院临床药理基地;3广西中医药大学中医基础研究重点实验室)

随着我国人口快速老龄化,心血管疾病在我国逐渐成为一种常见疾病。研究表明,心肌细胞凋亡是存在于多种心血管疾病中的共同病理现象,微小RNA-21(miR-21)在抗心肌细胞凋亡上具有重要作用,可通过调节靶基因程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达,调控血管平滑肌细胞和心肌细胞的凋亡、增殖,并参与氧化应激引起的细胞损伤[1]。中医认为心血管疾病具有共同的中医病理基础,本虚是心血管疾病的必要条件。四逆汤为东汉名医张仲景所创,收录于《伤寒论》,由附子、干姜、甘草组成,为温肾回阳救逆之名方。研究显示,四逆汤具有强心、耐缺氧、升压、抗休克、保护缺血心肌等药理作用[2,3],但其主要的机制仍不清楚,其能否调控miR-21的表达,从而影响心肌细胞的凋亡鲜见报道。2017年4月~2018年6月,我们通过体外建立大鼠心肌细胞损伤模型,探讨四逆汤对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的保护作用,并探讨其可能机制,为四逆汤拮抗心肌细胞损伤的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 动物与细胞 SPF级SD大鼠20只,雌雄各半,体质量(200±20)g,由长沙市天勤生物技术有限公司[动物生产/使用许可证号:SCXK(湘)2014-0011]提供。大鼠心肌细胞H9C2由上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.1.2 药品与试剂 四逆汤(附子15 g、干姜9 g、炙甘草6 g,由单味中药浓缩颗粒而成)。miR-21 mimic和miR-21 inhibitor(上海吉凯科技公司);DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA,美国Gibco公司);凋亡试剂盒Annexinv-APC/PI(美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO)为分析纯;CCK-8试剂盒(日本Dojindo Molecular Technologies公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒试剂盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ荧光定量试剂盒(日本Takala公司);磷酸盐缓冲液(PBS,北京索莱宝公司);水为超纯水。

1.1.3 仪器 CytoFlex型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司);5410型低温高速离心机(德国Eppendorf公司);BSC-1300Ⅱ B2型生物安全柜(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司);371型CO2培养箱、Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);IX71型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);7500 Fast型实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)系统(美国Applied Biosystems公司)。

1.2 四逆汤含药血清制备及浓度筛选

1.2.1 四逆汤组成 附子、干姜、生甘草剂量比例为5∶3∶2。

1.2.2 含药血清与正常对照血清制备 SD大鼠20只,取四逆汤颗粒,超纯水加热溶解,给予3.8 g/(kg·d)(用药剂量按人与动物体质量换算),2 mL/只灌胃[4],每日灌胃给药1次,连续给药14 d,于末次给药1 h后,以戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,分离血清,经0.22 μm微孔滤膜滤过后,于56 ℃水浴中灭活补体30 min,得四逆汤含药血清。同期饲养SD大鼠10只,雌雄各半,体质量约为200 g,每日灌胃生理盐水1次,14 d后同样方法取血,分离血清,得正常对照血清。

1.2.3 四逆汤含药血清浓度筛选

1.2.3.1 H9C2细胞培养 H9C2接种于培养瓶中,加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM为培养基,于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。隔天换液。待细胞长至80%左右,用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.3.2 适合心肌细胞生长的四逆汤含药血清浓度筛选 将H9C2细胞以1×105/mL的密度接种至96孔培养板中,每孔100 μL。预培养24 h,随机分为正常血清组和四逆汤含药血清组,每组再分三个浓度水平,其中正常血清组分别加入10%、5%、2.5%含正常大鼠血清的DMEM培养基,四逆汤含药血清组分别加入10%、5%、2.5%四逆汤含药血清的DMEM培养基。每组设3个复孔,将培养板置于37 ℃、5%CO2培养箱孵育24、48、72 h后,向每孔加入10 μL的CCK-8溶液,继续置于培养箱内孵育1 h,用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(以OD值表示),筛选DMEM培养基中最适合心肌细胞生长的四逆汤含药血清浓度及作用时间。结果表明10%四逆汤含药血清作用72 h后,细胞增殖明显增加,因此将10%含四逆汤药血清、作用72 h作为后续实验条件。

1.3 miR-21 mimic、miR-21 inhibitor细胞系构建 miR-21 mimic和miR-21 inhibitor腺病毒载体由上海吉凯科技公司设计并化学合成,分装于-80 ℃冰箱保存备用。将H9C2单细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶中培养(1×105/mL),细胞长至约80%时,加入重组慢病毒miR-21 mimic,以50 MoI滴度转染心肌细胞H9C2,24 h后吸弃培养液,继续培养,72 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率,转染效率90%以上达到要求,传代细胞备用。同样方法构建miR-21 inhibitor细胞系。荧光相差倒置显微镜下可见细胞形态完整,呈纤维状,大部分细胞显绿色荧光。阴性对照阳性表达率为0.04%,转染miR-21 mimic阳性表达率为96.13%,转染miR-21 inhibitor阳性表达率为96.34%,转染效率均达到90%以上,形态学和定量检测表明miR-21 mimic、miR-21 inhibitor均转染成功。

1.4 细胞分组及给药处理 细胞分别给予阿霉素损伤和无阿霉素处理,再各分为四个水平,分别加入miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、四逆汤+miR-21 mimic、四逆汤+miR-21 inhibitor,另设正常对照组及四逆汤组。共10组:正常对照组取H9C2细胞,在含10%正常大鼠血清的DMEM培养基中培养;四逆汤组取H9C2细胞,在含10%正常大鼠血清的DMEM培养基中加入四逆汤含药血清培养;miR-21 mimic组取miR-21 mimic细胞系培养;miR-21 inhibitor组取miR-21 inhibitor细胞系培养;四逆汤+miR-21 mimic组取miR-21 mimic细胞系,加入四逆汤含药血清培养;四逆汤+miR-21 inhibitor组取miR-21 inhibitor细胞系,加入四逆汤含药血清培养;ADR+miR-21 mimic组取miR-21 mimic细胞系,加入含阿霉素浓度为10 μg/mL的DMEM培养基培养24 h,吸弃培养液,PBS轻洗1次,继续培养;ADR+miR-21 inhibitor组取miR-21 inhibitor细胞系,加入含阿霉素浓度为10 μg/mL的DMEM培养基培养24 h,吸弃培养液,PBS洗1次,继续培养;ADR+四逆汤+miR-21 mimic组取miR-21 mimics细胞系,加入含阿霉素浓度为10 μg/mL的DMEM培养基培养24 h,吸弃培养液,PBS轻洗1次,加入四逆汤含药血清培养;ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组取miR-21 inhibitor细胞系,加入含阿霉素浓度为10 μg/mL的DMEM培养基培养24 h,吸弃培养液,PBS轻洗1次,继续培养,加入四逆汤含药血清培养。每个浓度组设3个平行孔。

1.5 细胞miR-21、PDCD4表达检测 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol法提取各组细胞总RNA,进行浓度、纯度检测后,按照SuperScript VILO cDNA合成试剂盒说明书,将mRNA逆转录为cDNA,以实时荧光定量核酸扩增检测(RT-qPCR)对PDCD4基因mRNA水平及内参基因β-actin水平进行检测。PDCD4采用NCBI的在线引物设计工具Primer-BLAST设计PCR引物,PDCD4上游序列5′-TGAGCACGGAGATACGAACG-3′,下游序列5′-AGGCTAAGGACACTGCCAAC-3′。PCR扩增采用Fast SYBR Green Master Mix试剂盒提供的扩增条件,RT-qPCR扩增后的原始CT值采用2-ΔΔCt方法计算后,进行相对定量分析基因表达水平。

使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒提取各组细胞miRNA后,使用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒,对所得miRNA同步进行加A尾反应和逆转录反应。对逆转录反应产物采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)进行RT-qPCR,miR-21-5p上游序列5′-GCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′,下游序列为试剂盒自带。RT-qPCR扩增后的原始CT值采用2-ΔΔCt方法计算后进行相对定量分析基因表达水平。

1.6 心肌细胞凋亡检测 采用流式细胞术。胰酶消化细胞,制成单细胞悬液,按凋亡试剂盒说明书,将100 μL细胞悬液加入5 mL的流式管中,加入Annexinv-APC和PI各5 μL,同时设定对照:对照1为单纯的活细胞,不加任何染料;对照2为活细胞只加Annexinv-APC;对照3为活细胞只加PI,轻轻混匀,室温、避光孵育15 min,加入400 μL连接缓冲液,1 h内用流式细胞仪检测,分析结果。细胞凋亡率=凋亡细胞数/所有细胞数×100%。

2 结果

2.1 各组miR-21表达比较 与正常对照组比较,miR-21 mimic组miR-21表达上升(P<0.01),miR-21 inhibitor组miR-21表达下降(P<0.05);与ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组miR-21表达上升(P<0.05);与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组miR-21表达上升(P<0.05)。见表1。

2.2 各组PDCD4表达比较 与正常对照组比较,miR-21 mimic组PDCD4表达下降(P<0.01),miR-21 inhibitor组PDCD4表达下降(P<0.05);与ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组PDCD4表达下降(P<0.05);与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组PDCD4表达下降(P<0.05)。见表1。

2.3 各组细胞凋亡率比较 与正常对照组比较,ADR+miR-21 mimic组、ADR+miR-21 inhibitor组、ADR+四逆汤组+miR-21 mimic、ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞凋亡率均上升(P<0.05或0.01);与ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组细胞凋亡率下降(P<0.05);与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞凋亡率下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞miR-21、PDCD4表达及细胞凋亡率比较

注:与正常对照组比较,*P<0.05;与ADR+miR-21 mimic组比较,﹟P<0.05;与ADR+miR-21 inhibitor组比较,△P<0.05。

3 讨论

自2006年首次发现miRNA在心血管疾病发生发展过程中的重要作用以来,目前已有大量文献报道miR-21与心脏或心肌多种生理、病理过程的变化有关[4,5],miR-21参与了心肌肥大增殖、氧化应激、缺血预适应、缺血再灌注损伤、心肌梗死的早期反应和心肌组织纤维重构等过程的调控。深入研究包括miR-21在内的多种对心血管系统的调控影响和作用机制,有助于从新的视角认识心血管系统的生理、病理变化过程,使其具有成为心血管疾病治疗靶点的可能。目前,中药与miRNA相关性的研究正受到普遍关注,调节细胞miRNA的表达很可能是某些天然药物产生疗效的分子机制之一[6,7]。

miR-21在抗心肌细胞凋亡作用的研究日渐受到重视,其参与了多种心血管系统疾病的发生发展。实验研究证实,miR-21具有抗损伤、抗凋亡及死亡的保护效应。PDCD4作为miR-21的靶基因,在肿瘤细胞凋亡的调控中起着重要作用。近年来,miR-21及其靶基因PDCD4在心肌梗死及心肌细胞凋亡方面的调控作用受到关注,众多研究都证实了其对心脏的保护作用。最近研究表明,miR-21可以减轻急性心肌梗死后心肌功能的损害,同时减少心肌细胞的凋亡,上调miR-21,从而抑制PDCD4的表达,可以明显地抑制氧化应激及缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[8]。本研究发现,ADR损伤后,H9C2细胞miR-21表达下降,PDCD4表达则增加。

中医认为,心血管疾病具有共同的中医病理基础,本虚是心血管疾的必要条件,多指脏器元气匮乏,导致功能运转失常。四逆汤为温里剂,具有回阳救逆之功效,主治心肌梗死、心力衰竭。现代药理研究表明,四逆汤对损伤的心肌细胞有保护作用[9,10],但其作用机制尚不明确。本实验试图从调节miR-21水平及其对靶基因PDCD4的调节方面,寻求中医名方四逆汤对心肌细胞保护作用的机制及靶点。本研究结果显示,与ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组miR-21表达上升、PDCD4下降、凋亡细胞百分率降低;而与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞miR-21表达上升、PDCD4下降、凋亡百分率降低。表明10%四逆汤含药血清作用72 h后能上调miR-21的表达、降低PDCD4的表达,抑制心肌细胞凋亡,从而抑制阿霉素导致的心肌细胞损伤,在细胞水平上进一步证实了四逆汤通过调节miR-21的表达,靶向抑制PDCD4,进而减少心肌细胞损伤。

综上所述,四逆汤能保护心肌细胞损伤,其机制可能是通过调节miR-21的表达,靶向调控PDCD4,从而减少心肌细胞凋亡来实现的。这一研究结果提示miR-21可作为防治心肌损伤的潜在靶点,具有潜在应用前景,同时也能为更深入研究四逆汤的分子作用机制提供实验基础。

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