lncRNA-uc.412重组质粒构建及在大鼠肾小球系膜细胞中的转染

陈俊宇，顾欣雨，顾靖钏，鱼敏逸，甘卫华，张爱青

(1 南京医科大学第二临床医学院，南京 210011；2 南京医科大学第二附属医院)

异常增殖的系膜细胞是肾小球病变中最常见的病理表现，见于各类原发性与继发性肾炎[1]。异常增殖的系膜细胞可分泌大量炎症因子引起系膜区基质沉积，最终造成肾脏的不可逆损伤，甚至进展为终末期肾病[2,3]。目前临床上主要通过免疫抑制剂等药物控制炎症因子，但治疗效果不理想。研究[4]发现，长链非编码RNA(lncRNA)因其较长的核苷酸序列而拥有多个功能结合域与三维结构，能够在多种分子信号通路中发挥调控作用，这提示了存在某种lncRNA成为系膜细胞增殖相关肾病防治的新靶点的可能性。本课题组前期以经典的系膜细胞异常增生模型——TGF-β1处理的大鼠系膜细胞为研究对象，采用高通量lncRNA微矩阵芯片技术筛选，并在临床患者肾活检组织中通过Realtime PCR检测验证lncRNA-uc.412的特异性，发现lncRNA-uc.412的表达水平与系膜细胞增殖程度显著相关，生物信息学分析结果显示，lncRNA-uc.412基因全长268 bp，位于人类17号染色体q12片段[5]。为进一步研究lncRNA-uc.412在系膜细胞中的潜在作用，本研究构建了lncRNA-uc.412的重组质粒，并成功转染至大鼠肾小球系膜细胞，为探讨lncRNA-uc.412在肾小球系膜细胞异常增殖相关肾病中作用的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 大鼠肾小球系膜细胞、大肠杆菌XL-10购自中国典型培养物保藏中心，限制性内切酶RsaⅠ和AluⅠ购自Promega公司，TRIzol试剂购自ThermoFisher公司，cDNA试剂盒、PCR试剂盒、RT-qPCR试剂盒、高保真DNA聚合酶、T4-DNA连接酶、嘌呤霉素、质粒中抽试剂盒及DNA Marker均购自TaKaRa公司，β-actin、一抗、二抗均购自Proteintech Group公司，ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术公司，pRP[Exp]载体质粒(含有EGFP荧光标签、嘌呤霉素抗性基因、CAG真核启动子基因片段)购自北京普如汀生物技术有限公司，PCR上、下游引物购自上海捷瑞生物有限公司。

1.2 lncRNA-uc.412的引物设计、PCR扩增与提取 使用BLAST网站，根据lncRNA-uc.412基因组序列数据的功能编码区序列和载体质粒pRP[Exp]序列特点，分别选择限制性内切酶RsaⅠ和AluⅠ作为上、下游引物的酶切位点，设计出PCR引物序列：上游引物为5′-CGCGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCGAGCCTGCCTCTTGAAT-3′，下游引物为5′-CCCAGCTACCCTTCATTCAAATCCACACAAGC-3′。通过TRIzol法提取大鼠肾小球系膜细胞总RNA，核酸/蛋白质定量荧光计分析测定RNA纯度和浓度。取1 μg样品，根据逆转录试剂盒的使用说明方法进行cDNA的合成；取1 μg cDNA加入PCR反应体系进行扩增：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。以10 g/L的琼脂糖凝胶为电泳介质分离出PCR终产物中的目的基因片段，得到大小在200～300 bp的特异性条带。目的基因片段大小与预期得到的扩增长度相符，提示成功提取出lncRNA-uc.412基因片段。切取相关凝胶并通过回收试剂盒获取与纯化lncRNA-uc.412基因片段。

1.3 lncRNA-uc.412重组质粒的构建 将质粒pRP[Exp]与PCR扩增所得的lncRNA-uc.412基因片段分别经含RsaⅠ和AluⅠ的双酶体系处理，酶切后产物通过凝胶电泳分离纯化，统一收回后混合并加入T4-DNA连接酶，16 ℃过夜，即获得lncRNA-uc.412重组质粒。

1.4 lncRNA-uc.412重组质粒的双酶切鉴定与测序 ①lncRNA-uc.412重组质粒的双酶切鉴定。将大肠杆菌XL-10用42 ℃水浴加热10 min转至感受态，4 ℃降温3 min后，将其与lncRNA-uc.412重组质粒混合，使用移液器转移500 μL含质粒与大肠杆菌的混合物至含有嘌呤霉素的LB固体培养基上，涂菌棒均匀涂布，倒置于37 ℃恒温箱中过夜后，挑取单克隆菌接种于含1 mL LB液体培养基的离心管中，37 ℃摇菌1 h后，各取150 μL分别接种于含有嘌呤霉素的LB液体培养基培养瓶中，37 ℃摇菌16 h，根据质粒中抽试剂盒使用说明方法裂解细菌、提取质粒，使用Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶处理重组质粒，获得重组质粒中的lncRNA-uc.412基因片段。将lncRNA-uc.412基因片段与DNA Marker混合进行琼脂糖凝胶电泳分离，检测目的基因片段大小。②lncRNA-uc.412重组质粒的测序。选取经双酶切鉴定连接成功的lncRNA-uc.412重组质粒，PCR扩增后送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序，使用仪器为DNA全自动测序仪。

1.5 lncRNA-uc.412重组质粒的转染与观察 使用含10% FBS的高糖DMEM培养基体外培养大鼠肾小球系膜细胞，胰酶联合EDTA消化贴壁生长的肾小球系膜细胞，稀释细胞浓度至2×105/L，分别转移2 mL细胞悬浮液至6孔板中，24 h后观察到细胞贴壁后换液，采用脂质体转染法转染lncRNA-uc.412重组质粒和空白质粒pRP[Exp]，分别记为实验组和阴性对照组，转染6 h后换液，48 h后消化收集细胞，离心去上清后加入DEPC无菌水，-20 ℃保存。以Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶作为上、下游引物的酶切位点设计PCR引物序列：上游引物为5′-CTTGAATTCCAAGCAGCACA-3′，下游引物为5′-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3′。通过TRIzol法提取实验组和阴性对照组细胞的总RNA，以GAPDH为内参进行RT-qPCR扩增：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环，每个循环收集一次荧光信号以建立扩增曲线；95 ℃预变性15 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，监测该反应条件下荧光信号随温度的变化并建立溶解曲线以验证扩增产物的特异性。用2-ΔΔCt表示大鼠肾小球系膜细胞中lncRNA-uc.412的相对表达量。

2 结果

2.1 lncRNA-uc.412重组质粒的双酶切鉴定与测序结果 ①lncRNA-uc.412重组质粒的双酶切鉴定结果显示，得到大小在200～300 bp的特异性条带，与lncRNA-uc.412的长度相符，见图1。②测序结果显示，lncRNA-uc.412重组质粒的碱基序列与理论预期序列一致，见图2。

图1 lncRNA-uc.412重组质粒的双酶切产物电泳条带

图2 lncRNA-uc.412重组质粒的部分碱基序列

2.2 lncRNA-uc.412重组质粒在大鼠肾小球系膜细胞中的表达观察 以转染空白质粒pRP[Exp]的阴性对照组中大鼠系膜细胞中lncRNA-uc.412的相对表达量为标准，记为1.00±0.00，实验组大鼠肾小球系膜细胞中lncRNA-uc.412的相对表达量为8.01±0.97，两组相比，P<0.05。

3 讨论

研究[6，7]显示，不编码任何蛋白质的lncRNA可作为重要的调控分子发挥多种生物学功能，甚至已有lncRNA被证实能与某些增殖调控相关的信号因子相互作用，如lncRNA-MEG3可直接与p53基因结合进而激活p53介导的下游反应，lncRNA-HULC可通过HULC抑制miR-15a的成熟而减少PTEN的表达。lncRNA的作用方式多样，研究[8～10]显示，lncRNA一方面能通过碱基互补配对原则与DNA或RNA结合，激活或沉默靶向DNA的表达，或者与miRNA形成无功能结合从而抑制miRNA的表达；另一方面，lncRNA凭借其较长的碱基序列长度拥有三维结构域与多个功能域，三维结构能使lncRNA直接结合蛋白质，激活下游蛋白的活性或提高其稳定性，多个功能域的特性使lncRNA能作为诱饵分子招募多种信号分子的定向聚集并发生反应，这些都是lncRNA-uc.412可能的作用方式与研究方向[11]。

本研究成功构建了lncRNA-uc.412重组质粒，该质粒携带有lncRNA-uc.412基因全长序列、EGFP荧光标签、嘌呤霉素抗性基因puro、CAG真核启动子。其中，EGFP有利于比较质粒转染效率；嘌呤霉素抗性基因puro有助于质粒扩展或转染后的筛选；CAG启动子有助于lncRNA-uc.412的高表达，为对比观察lncRNA-uc.412生物学功能与相关信号通路提供基础。

目前尚无有关系膜细胞增殖相关肾病与lncRNA-uc.412的研究报道，而本研究成功转染了lncRNA-uc.412重组质粒至大鼠系膜细胞内，并特异性提高了转染后大鼠系膜细胞的lncRNA-uc.412的表达水平，该结果对于肾病发生发展的进一步研究有很大意义，为探索系膜细胞增殖相关肾病的分子学相关通路提供了新的思路。有研究[12]显示，系膜细胞虽然不参与滤过屏障的构成，但与血管内皮细胞、足细胞直接相邻，三者的病理改变往往引起互相之间的继发性损伤，而lncRNA-uc.412的表达水平与系膜细胞的异常增殖密切相关，lncRNA-uc.412可能在各种原发性与继发性肾损伤中扮演重要角色。另一方面，lncRNA-uc.412作为作用方式多样的lncRNA，可能通过作用于多种信号通路或在参与病理状态下系膜细胞增殖的调控，甚至可能因病理时期的不同而作用于不同的调控路径，出现双向调控的特性，如lncRNA H19就被发现了这种调控特点。研究[13]结果显示，系膜细胞增殖的调控在不同病理时期涉及多种不同的信号通路。在增殖前，NADPH氧化酶的启动、转录激活因子(STAT)的磷酸化、炎症相关基因(如TNF-α、IL-6等)的表达增加，都可促使了系膜细胞的异常增殖；在增殖过程早期，血小板衍生因子B直接诱发了系膜细胞的增殖与细胞外基质的合成增加[14,15]；在增殖后期，p53/Caspase-8或PTEN-PI3K/AKT信号通路的激活诱导了系膜细胞的自噬与凋亡，从而抑制细胞过度增殖并保护肾功能[16,17]。

综上所述，本研究成功构建了lncRNA-uc.412重组质粒，并成功转染至大鼠肾小球系膜细胞，为进一步深入研究lncRNA-uc.412在肾小球系膜细胞中的生物学功能与探索肾小球系膜细胞增殖相关肾病的防治奠定了基础。