卡那霉素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

王爱萍， 孙换平， 刘燕凯， 黄进勇， 陈玉梅，祁艳华， 李永欣， 张改平

(郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)

0 引言

卡那霉素是一种由土壤中链霉菌素产生的氨基糖苷类抗生素，具有良好的水溶性和广谱的抗菌性，它对多数肠杆菌科细菌均有良好的抗菌作用，通常作为抗菌药物用于动物饲养，是我国畜牧业常用的兽药之一.然而，氨基糖苷类抗生素具有耳毒性、肾毒性、以及神经肌肉阻滞引起的心肌抑制、呼吸衰竭等毒副作用[1].动物体内过量的卡那霉素残留，通过食物链的富集，对人类健康具有潜在的威胁，因此，检测食品中卡那霉素的残留十分重要.目前检测氨基糖苷类抗生素残留常用的方法主要包括高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法[2]、免疫学检测法[3]等.其中HPLC等色谱方法虽然灵敏度高，但对技术的要求较高，并且样品处理比较复杂，测试成本高，不适合快速筛查大批量样品[4].免疫学检测法作为一种快速、特异和灵敏的检测技术，被广泛应用于小分子药物残留的检测.在本研究中，我们制备了卡那霉素单克隆抗体，建立了间接竞争酶联免疫吸附试验(indirect competitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay, ciELISA)方法.

1 材料与方法

1.1 材料

3只6周龄的雌性BALB/c小鼠由本实验室动物房饲养；卡那霉素(KAN)、碳二亚胺(EDC)购于Solarbio公司；弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund incomplete adjuvant，FIA)购自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1EDC法合成完全抗原 将100 mg卡那霉素标准品与20 mg BSA或20 mg OVA溶到2 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，此溶液称为1号液，将25 mg EDC溶于1 mL PBS(50 mmol/L)中，此溶液称为2号液.将1号液和2号液混合，在室温下缓慢搅拌1 h，然后在4 ℃下搅拌3 d.将所得反应混合物用10 mmol/L PBS(3 L)透析3次并收集于1.5 mL试管中，该方法制备的偶联物命名为KAN-BSA和KAN-OVA，放置于-20 ℃冰箱保存.采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定完全抗原浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.

1.2.2动物免疫及杂交瘤细胞的筛选 将KAN-BSA作为免疫抗原，并对每只小鼠进行皮下注射50 μg/200 μL，使用KAN-OVA作为包被抗原，通过间接ELISA测定小鼠免疫血清效价，并选择具有高效价的小鼠，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经3轮亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞株，具体实验步骤参照文献[5].

1.2.3单克隆抗体的大量制备及鉴定 将筛选到的杂交瘤细胞株转移至细胞培养瓶中，并用 RPMI1640/10 完全培养基在细胞培养瓶内扩大培养，当细胞达到对数增长状态时，向石蜡致敏的经产母鼠腹腔中注射每毫升 1×106个细胞，约10天后小鼠腹部肿胀，此时，收集腹水，离心收取上清液，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水[6]，用SDS-PAGE鉴定纯化的单克隆抗体，并通过间接ELISA法测其效价与亲和力.

1.2.4确定最适抗原包被量及单克隆抗体稀释度 采用棋盘法连续倍比稀释包被抗原KAN-OVA和卡那霉素单克隆抗体，抗原包被量分别为800、400、200、100、50 ng/孔，单克隆抗体稀释倍数从1∶800开始2倍比稀释至1∶204 800.

1.2.5间接竞争ELISA的建立及标准曲线的绘制 以KAN-OVA作为包被抗原，包被量为200 ng/孔，4 ℃孵育过夜；PBST洗6次，用封闭液37 ℃封闭2 h.PBST洗6次后分别将各质量浓度标准品溶液(KAN：用双蒸馏水配制卡那霉素标准品，用0.01 M PBS倍比稀释到质量浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125 ng/mL)与最适稀释倍数的单克隆抗体等体积混合作为一抗，向各孔中加入100 μL混合液，同时设置阳性、阴性和空白对照组，二抗加入100 μL 1∶4 000稀释的羊抗鼠IgG，TMB显色8 min，2 mmol/L H2SO4终止反应，OD450 nm条件下测定OD值.

1.2.6间接竞争ELISA准确度分析 在同一批ELISA酶标板上进行6组竞争ELISA平行试验，作批内变异系数分析；同时，包被6批酶标板，分别各进行一次竞争ELISA检测，做批间变异系数分析，研究不同标准品浓度测定结果的准确性.

1.2.7交叉反应率的确定 链霉素、妥布霉素、卡那霉素B、新霉素、新霉胺以及庆大霉素属于卡那霉素结构类似物[7]，以相同的竞争ELISA方法测定这几种药物的IC50，根据式CR=IC50(KAN)/IC50(其他)×100%[8]计算单克隆抗体对于链霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素等的交叉反应率.

1.2.8样品加标回收率的测定 牛奶样品处理方法：选取牛奶，向不含卡那霉素的牛奶样品中添加卡那霉素标准品，12 000 r/min，4 ℃离心10 min后，除去上层脂肪层及沉淀物，用0.01 mol/L PBS将中间清液分别稀释2、4、8倍，使不同稀释倍数的牛奶中含卡那霉素终质量浓度分别为6.25、12.5、25 ng/mL.间接竞争ELISA方法用于检测牛奶样品中的卡那霉素，根据公式(实际检测浓度/添加浓度×100%)，计算其回收率.用不同稀释倍数的牛奶，分别测定20个不含卡那霉素牛奶样品的平均值，根据其平均值加上3倍标准偏差再乘以样品稀释倍数，得到其最低检测限.

2 结果与分析

2.1 KAN-BSA、KAN-OVA完全抗原的制备与鉴定

将制备得到的KAN-BSA和KAN-OVA完全抗原，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示.KAN-BSA和KAN-OVA比BSA和OVA有明显的拖尾现象，表明KAN与BSA、OVA偶联成功.采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定KAN-BSA和KAN-OVA的质量浓度分别为3.9 mg/mL、4 mg/mL.

2.2 小鼠免疫效果评价

间接ELISA测定小鼠免疫血清效价，结果显示，3只小鼠均能产生特异性抗体，其中1号小鼠抗体效价为1/25 600(图2)，所以选取1号小鼠取其脾脏做细胞融合用于制备抗KAN单克隆抗体.

2.3 抗KAN单克隆抗体的制备及纯化

细胞融合后，经3次亚克隆获得1株阳性杂交瘤细胞株(1E1)，并通过体内诱生法大量制备腹水，经辛酸-硫酸铵法纯化获得单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定分析，结果如图3所示，纯化后1E1含有两条特异性条带，分子量大小分别为50 kD和25 kD，与IgG的重链和轻链大小相一致.

a1:BSA;a2:KAN-BSA;b1:OVA;b2:KAN-OVA图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定完全抗原Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of complete antigen

1：Marker；2: 1E1单克隆抗体纯化前；3: 1E1单克隆抗体纯化后图3 1E1单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of 1E1 mAb purification

2.4 1E1单克隆抗体的效价和亲和力

间接ELISA测定单克隆抗体1E1纯化前、后效价，结果显示其效价均达到1∶819 200(图4a)；根据亲和常数计算公式可以得出1E1单克隆抗体的亲和常数Ka为2.8×109L/mol(图4b).

2.5 间接竞争ELISA的建立及标准曲线绘制

棋盘法确定抗原包被量及单克隆抗体稀释度，以OD450 nm为1.0左右的组合为最佳模式.考虑到节约检测原KAN-OVA，适量使用单克隆抗体原则，最后确定间接竞争ELISA最佳包被抗原KAN-OVA的包被量为200 ng/孔，最适单克隆抗体稀释度为1∶51 200(表1).

图4 a:1E1单克隆抗体效价的测定；b:1E1单克隆抗体亲和常数分析Fig.4 a: Titer of 1E1 mAb; b: Affinity analysis of 1E1 mAb

包被量/(ng·孔-1)单克隆抗体稀释倍数8001 6003 2006 40012 80025 60051 200102 400204 800 8003.3123.2853.0022.6242.2381.8611.3560.9310.664003.1333.1783.1712.4772.1661.6181.0870.7610.5512002.9752.8772.6212.5092.2081.6511.0090.8370.4971002.3642.2321.9991.7561.4721.2560.8670.5690.393501.9571.8001.6061.3081.2400.9570.6770.5220.331

图5 单克隆抗体敏感性测定Fig.5 Sensitivity test of 1E1 mAb

2.6 间接竞争ELISA标准曲线

以添加卡那霉素质量浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线(图5)，拟合标准曲线后得到的线性方程为y=-24.403x+50.919(R2=0.989 8).以抑制率为50%时对应的质量浓度为IC50，测得1E1的IC50值为1.09 ng/mL.

2.7 间接竞争ELISA方法的精确度分析

各标准品浓度批内变异系数范围是5.48%～8.72%，平均变异系数为6.52%.各标准品浓度批间变异系数范围是6.86%～8.76%，平均变异系数为8.04%.这表明本实验建立的间接竞争ELISA检测方法具有高稳定性.

表2 板内与板间变异系数Tab.2 Coefficient of variation within and between plates

2.8 间接竞争ELISA方法的交叉反应率

分别选用链霉素、妥布霉素、卡那霉素B、新霉素、新霉胺以及庆大霉素进行交叉反应性试验，如表3所示，采用间接竞争ELISA法测得抗卡那霉素单克隆抗体对妥布霉素、卡那霉素B的交叉反应率分别为53.4%和45.6%，与其他氨基糖胺类化合物的交叉反应率低于0.01%.

表3 交叉反应试验结果Tab.3 Cross-reaction test results

2.9 样品加标回收率

不含卡那霉素的牛奶样品中分别加入卡那霉素，使终质量浓度分别为6.25、12.5、25 ng/mL，测定样品加标回收率，根据1.2.8的计算方法，结果如表4所示，当牛奶稀释2倍时回收率范围为42%～78%，最低检测限为1.72 ng/mL；稀释4倍时回收率范围为64.4%～89.6%，最低检测限为1.92 ng/mL；稀释8倍时回收率范围为53%～95.7%，最低检测限为3.52 ng/mL.综合分析上述结果，考虑到灵敏性及最低检测限，稀释4倍作为最适样品稀释倍数.此时样品加标回收率范围为64.4%～89.6%，最低检测限为1.92 ng/mL.

表4 ciELISA检测牛奶样品的添加回收试验Tab.4 Recovery of milk samples by ciELISA

3 讨论

卡那霉素为小分子半抗原，检测困难，常规检测方法复杂且价格高昂，需要昂贵的仪器设备及专业技术人员.卡那霉素结构中不含有共轭双键，无紫外吸收峰[9]，因此，不能采用紫外分光光度法对完全抗原进行鉴定.因为BSA和OVA的等电点在4.6～4.7之间，在琼脂糖凝胶电泳缓冲溶液中带负电，将其与KAN偶联后其等电点会升高，从而导致其在电泳缓冲溶液中所带负电荷减少，同样条件下电泳速度减慢.所以本研究通过琼脂糖凝胶电泳的方法对合成的完全抗原进行鉴定，结果显示与载体蛋白相比，合成的完全抗原有明显的滞后和拖尾现象，表明KAN与载体蛋白偶联成功.

经免疫BALB/c小鼠，选用经典的杂交瘤细胞融合技术获得一株稳定分泌抗KAN单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株，用小鼠体内诱生腹水并经辛酸-硫酸铵法纯化获得单克隆抗体1E1，间接ELISA测其效价为1∶819 200，亲和力常数为2.8×109L/moL.建立了基于单克隆抗体1E1的间接竞争ELISA检测KAN的方法，结果显示1E1与妥布霉素的交叉反应率为53.4%，与卡那霉素B的交叉反应率为45.6%，与其他氨基糖苷类化合物没有交叉反应，该特性与CHEN等[10]制备的单克隆抗体情况类似.经分析，卡那霉素B、妥布霉素与卡那霉素具有相似的C-环结构，其他氨基糖苷类抗生素与卡那霉素的C-环结构有明显差异，所以与妥布霉素和卡那霉素B交叉反应性高，可能是因为它们具有相似的C-环结构.因此推测此单克隆抗体能够与卡那霉素类的抗生素反应.

单克隆抗体在牛奶样品稀释4倍时最低检测限为1.92 ng/mL，根据我国《食品安全国家标准动物性食品中兽药最大残留限量》规定，卡那霉素最大残留限量为肌肉100 μg/kg、奶150 μg/kg、肝脏600 μg/kg.本研究最低检测限1.92 ng/mL，可完全满足检测限量要求.该方法具有准确、敏感、快速、操作简便且费用低廉的优点，为卡那霉素残留的快速检测提供了有效检测方法，保障了畜产品的安全.