TLR4-TRPC6在LPS致16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位的作用*

李业盛， 凌振威， 陈庆梓， 吴佑森， 叶绮婷， 温启锐， 戴永亮， 李建华， 周丽芬△

(1广州医科大学基础学院基础医学研究中心， 广东省高校蛋白质修饰与降解重点实验室,2广州医科大学附属第三医院第三临床学院， 广东 广州 511436)

呼吸道疾病(如慢性阻塞性肺病、支气管哮喘和过敏性鼻炎等)的患病率及死亡率逐年上升[1]，严重影响了全世界亿万人的身体健康，这类呼吸道疾病的病理生理过程通常伴有气道炎症反应，但其发病机制目前尚未阐明。气道上皮细胞是呼吸道的第一道生理屏障，其与吸入的各种刺激物(如病原体、污染物和变应原)直接接触，可作为启动和促发炎症反应的始动环节[2]。经典瞬时受体电位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)是一种非选择性钙离子通道，其基因编码的蛋白在人体脑、肾和肝等多个器官中均有表达，而在肺脏中的表达尤为丰富[3]。本课题组前期研究[4]发现，细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通过其受体Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号通路诱导气道上皮细胞16HBE内TRPC6的过表达及钙动员，使细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase，ERK1/2)、p38和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)发生磷酸化，从而引发炎症反应。NF-κB是由P65和P50组成的异源二聚体，其作为一种多功能核转录因子，能促进细胞因子、趋化因子和黏附分子等的转录和翻译，在机体细胞的生长发育、免疫应答以及炎症反应等方面发挥重要作用[5]。当抑制因子IκB与NF-κB二聚体相结合时，NF-κB以失活状态存在于胞浆中；当受到外源刺激时，IκB经泛素化和蛋白酶途径降解后与NF-κB二聚体发生解体，从而使NF-κB发生活化和核转位发挥转录调节的作用。本文探讨TLR4/TRPC6在LPS诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位的作用，以期了解气道上皮细胞发生炎症反应时LPS除了使NF-κB磷酸化，能否通过TLR4/TRPC6调控NF-κB的表达和核转位，从而为气道炎症的发生机制补充新的内容。

材 料 和 方 法

1 细胞和主要试剂

气道上皮细胞株16HBE购自广州吉尼欧生物科技有限公司。胎牛血清和高糖DMEM培养液购自Gibco；TRIzol购自Invitrogen；RT-PCR试剂盒购自TaKaRa；LPS、CLI-095和Hyp9购自Sigma；抗TRPC6抗体和山羊抗兔 II 抗购自CST；抗NF-κB P65抗体购自Abcam；山羊抗兔免疫荧光II抗购自北京中杉金桥公司；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 主要方法

2.1细胞培养 16HBE细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养于25 mL培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每天换液1次，待细胞于对数生长期时用于实验。实验前将含10%胎牛血清的培养基换成无血清培养基培养24 h，然后按参考文献[4]方法加入CLI-095(5 μmol/L)、Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)处理16HBE细胞。

2.2RT-PCR实验 收集待测样本，加1 mL TRIzol后常规方法分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度计测定总RNA的含量及浓度。按照RT-PCR试剂盒提供的方法，将2 μL RNA逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增，总反应体积为20 μL，其中2 μL 10×Ex Taq缓冲液(Mg2+Plus)、0.1 μL TaKaRa Ex Taq酶(5×106U/L)、1.6 μL混合dNTP(2.5 mmol/L each)、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL下游引物(10 μmol/L)、2 μL cDNA模板(100 ng)和12.7 μL无RNA酶去离子水。PCR引物序列由英潍捷基(上海公司)合成，序列见表1。反应参数为: 95 ℃预变性5 min； 94 ℃变性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s(NF-κB P65进行30个循环，β-actin进行25个循环)；循环结束后72 ℃再延伸5 min。取PCR产物10 μL与上样缓冲液2 μL混合，行2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统拍照后用ImageJ软件分析各目的基因条带灰度与β-actin条带灰度的比值。

表1 RT-PCR引物序列

2.3Western blot实验 细胞吸出培养液，用预冷PBS缓冲液冲洗3遍，加入4%细胞裂解液，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，取适量总蛋白进行SDS-PAGE，将总蛋白用湿法转膜转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入I 抗4 ℃封闭过夜，TBST缓冲液洗膜，加入II 抗室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜，ECL发光显影，以目的蛋白与内参照GAPDH的吸光度之比作为其相对表达量。

3.4免疫细胞化学染色法 各组细胞用PBS冲洗3遍后，迅速用冰甲醇固定10 min，0.3% Triton X-100 室温通透10 min，加入山羊血清室温封闭30 min，然后用抗NF-κB P65抗体4 ℃封闭过夜；次日复温30 min后用PBS 洗3遍后，加入II 抗37 ℃避光孵育2 h，DAPI染核，5%甘油封片镜检，采用免疫荧光和激光共聚焦显微镜观测NF-κB P65的荧光表达及亚细胞定位。

3 统计学处理

用SPSS 20.0统计软件分析数据。全部计量资料采用均数±标准误(mean±SEM)表示。多组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，运用最小显著性差异法(LSD法)进行组间两两比较，并运用Bonferroni校正的t检验进行组间多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 LPS上调16HBE细胞NF-κB P65的表达和核转位

16HBE细胞接种于6孔板内培养至50%～60%密度融合时将含10%胎牛血清的培养基换成无血清培养基，培养24 h，加入LPS(1 mg/L)分别刺激细胞0、0.5、2、6、12和24 h后，使用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法分别检测16HBE 细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达以及核转位的情况。结果显示与正常组相比，LPS作用于16HBE细胞6 h后，NF-κB P65的mRNA和蛋白表达开始显著上调，持续到24 h(P<0.05)，见图1A、1B；在LPS作用2 h时NF-κB P65开始出现核转位，随着时间的延长，核转位越来越明显，见图1C。

Figure 1.The effects of LPS stimulation on NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells at different times. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B: the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C: the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining (×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vs0 h group.

图1 LPS刺激不同时点对16HBE细胞NF-κB P65表达与核转位的影响

2 TLR4介导LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的表达上调和核转位

16HBE细胞接种于6孔板内，待生长密度至50%～60%时将含10%胎牛血清的培养基换成无血清培养基培养24 h,后分成对照(control)组、LPS组和LPS+CLI-095组,CLI-095(5 μmol/L)预处理30 min后加入LPS(1 mg/L)处理16HBE细胞6 h，使用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法分别检测细胞内NF-κB P65 的mRNA和蛋白表达以及核转位。结果显示TLR4抑制剂CLI-095能明显抑制LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的表达以及核转位(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The effects of TLR4 inhibitor CLI-095 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

图2 TLR4抑制剂CLI-095对LPS诱导16HBE细胞NF-κB P65表达以及核转位的影响

3 TRPC6介导LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的表达上调和核转位

16HBE细胞接种于6孔板内，待生长密度至50%～60% 融合时，将生长培养基换成无血清培养基培养24 h，后分成control组、LPS组、Hyp9组和LPS+Hyp9组。单独或同时加入Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)刺激16HBE细胞6 h，应用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法分别检测16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达以及核转位情况。结果显示与正常组相比，Hyp9组和LPS组的NF-κB P65表达均明显增加并出现核转位，且LPS+ Hyp9组比单独的Hyp9组和LPS组NF-κB P65的表达增加(P<0.05),核转位现象更为明显，见图3。

讨 论

NF-κB在多种肺部疾病，如急性肺损伤、肺部感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及肺纤维化中发挥着至关重要的作用。Bureau等[6]发现，与一般炎症不同的是，即使撤去致敏原，哮喘动物气道细胞中的NF-κB仍持续活化，而一些公认的NF-κB激活物，如过敏原、臭氧和LPS等可使哮喘症状恶化；反之，如果阻断NF-κB的活化可以减轻LPS诱导的大鼠气道炎症[7]。Hart等[8]利用凝胶电泳迁移率变动分析和免疫组化技术发现，轻度哮喘患者的支气管活检标本和痰液中NF-κB的活化程度较正常人高，且NF-κB表达在气道上皮细胞和炎症细胞上，这些研究提示，NF-κB是气道炎症相关疾病防治的潜在靶点。本课题组前期研究[4]发现，1 mg/L LPS作用16HBE细胞6 h后炎症因子白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-8开始显著增高，持续到24 h。在本实验中，同样采用1 mg/L LPS刺激16HBE细胞6 h，NF-κB表达和核转位的变化规律与前期研究一致。TLR4是天然免疫系统识别病原微生物抗原的主要受体。本研究采用TLR4的抑制剂CLI-095处理16HBE细胞后，LPS诱导的NF-κB P65的表达以及核转位显著下降，进一步表明TLR4介导LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的表达上调和核转位。

Figure 3.The effects of TRPC6 activator Hyp9 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHyp9 group;&P<0.05vsLPS group.

图3 TRPC6激动剂Hyp9对LPS诱导16HBE细胞NF-κB P65表达以及核转位的影响

TRPC6参与调控动物体内细胞周期、细胞分化和细胞凋亡等一系列的生理和病理过程，其基因突变或过表达可导致胞内钙离子信号通路异常从而引起多种病理生理改变[9]。最近研究发现[10-11]，当内皮细胞受到各种炎症介质的刺激时能被TRPC6调控从而增加细胞膜通透性。还有研究发现，慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者中TRPC6的mRNA表达较正常组上调[12-13]。另外，Sel等[14]用卵白蛋白急性致敏TRPC6基因敲除小鼠建立气道炎症模型，TRPC6敲除可以减弱小鼠的过敏性反应，且TRPC6介导的免疫功能主要定位在Th2淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、B淋巴细胞和肥大细胞。有趣的是，Damann等[15]也发现TRPC6敲除小鼠来源的中性粒细胞的迁移能力较正常组减弱。以上研究提示，TRPC6在气道炎症反应中起重要作用，然而其在气道上皮细胞中的作用尚不明确。本课题组前期研究[4]发现，TRPC6可调控LPS诱导的16HBE细胞中炎症因子IL-6和IL-8的分泌以及NF-κB P65的磷酸化水平。另外，研究还发现TLR4特异性抑制剂CLI-095可拮抗LPS诱导的TRPC6 mRNA和蛋白表达上调，表明TLR4是TRPC6的上游信号通路。Hyp9作为一种简化的二乙酰间苯三酚衍生物可以选择性激活TRPC6通道，引起钙离子内流[4, 16]。本研究进一步使用TRPC6的激动剂Hyp9处理16HBE细胞后发现LPS诱导的NF-κB P65表达和核转位明显增加。以上研究表明，TLR4-TRPC6信号通路除了使NF-κB磷酸化，还能调控NF-κB P65表达和核转位。

综上所述，LPS通过TLR4-TRPC6信号通路调控气道上皮细胞内NF-κB P65的表达和核转位，不仅为TRPC6调控气道上皮细胞炎症反应的作用机制补充新的内容，也为气道炎症性呼吸道疾病的防治提供靶点。