远程缺血后处理抑制心肺复苏后大鼠海马神经细胞自噬*

谢 彪， 高旭辉， 黄 洋， 周 翔， 谭智天， 朱水波△

(中国人民解放军中部战区总医院 1心胸外科， 2麻醉科， 湖北 武汉 430070)

自噬(autophagy)是指细胞内的长寿命蛋白质以及受损的细胞器经溶酶体途径被降解的过程，广泛参与生长发育、免疫、新陈代谢和老化等生理性过程，普遍存在于真核细胞中。近期研究表明，细胞自噬的过度激活可导致另一种程序性细胞死亡——自噬性细胞死亡。远程缺血后处理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)是在远端器官或部位进行短暂的、非致死性缺血和再灌注的处理方式。大量研究表明，这种处理方式可减轻心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)后神经功能障碍，然而其诱导的内源性保护机制还不明确。本研究采用夹闭气管导管建立窒息性心脏停搏(cardiac arrest，CA)/CPR模型，观察远程缺血后处理对心肺复苏后大鼠海马神经细胞自噬水平的影响，并初步探讨其保护机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物与分组

雄性清洁级SD大鼠45只，体重200～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物许可证为SCXK(鄂)2016-0009。随机分为3组，即假手术组(sham组，n=15)、CA/CPR组(n=15)和RIPostC组(n=15)。饲养室通风、恒温23 ℃，标准鼠料饲养。

2 实验方法

2.1大鼠窒息性(CA/CPR)模型的建立 实验大鼠术前禁食12 h，不禁水。2%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，肢体导联连接监测心电图。右侧股动脉置入24G静脉留置管，通过预充肝素的延长管连接压力换能器，以Powerlab系统监测血压。左侧股静脉置入24G静脉留置管，接输液装置，以备输注急救药物。经口置入16G静脉留置针软套管，置管成功后作颈部正中切口，分离气管予以粗线结扎，以防止机械通气时漏气影响窒息时心跳骤停效果。连接小动物呼吸机行机械通气，调节呼吸参数，呼吸频率60 min-1，潮气量6 mL/kg，FiO221%，稳定10 min。在呼气末夹闭气管导管，密切观察大鼠血压和心电图变化，以收缩压(systolic blood pressure，SBP)≤25 mmHg作为心跳骤停标准。达到心跳骤停标准后开始计时，持续5 min后开始机械通气，呼吸频率80 min-1，潮气量6 mL/kg，FiO221%，同时依据节拍器节奏行快速、标准胸外按压，按压频率200 min-1，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3，先后经股静脉快速注射肾上腺素(0.04 mg/kg)和1 mL万汶(羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液)，并记录血压、心率和心电图。若出现自主心律，且SBP高于60 mmHg并能维持10 min，则判定为自主循环恢复(return of spontaneous circulation，ROSC)，若按压3 min仍未出现自主心律或SBP低于60 mmHg则放弃抢救，视为复苏失败。复苏成功者继续呼吸机支持，自主呼吸恢复满意即可停止机械通气，结扎股动、静脉并缝合皮肤切口，术后每6 h腹壁皮下注射10%葡萄糖2 mL，直至动物能自主饮水进食，放入单独的鼠笼，置入23 ℃恒温鼠舍继续喂养。Sham组大鼠仅行动、静脉插管和气管插管等操作。

2.2远程缺血后处理 大鼠自主循环恢复后即刻用动脉夹夹闭左侧股动脉5 min，再释放5 min，依次重复3个循环。

2.3神经功能缺损评分(neurological deficit scoring，NDS) 由1名不清楚实验分组的人员于自主循环恢复后对实验动物进行NDS评分，分别从一般行为、脑干反射、运动及感觉评估、行为学及癫痫发作等方面来评估神经功能，范围为0～80分，80分为正常，0分为脑死亡。

2.4Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的表达 大鼠处死后取新鲜海马组织，经过裂解，提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE，蛋白质转膜，显色，曝光，扫描胶片，结果用分析软件ImageJ进行处理，GAPDH作为总蛋白内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

2.5TUNEL法检测神经细胞凋亡 石蜡包埋切片，常规脱蜡，滴加蛋白酶K工作液，复染核，封片，荧光显微镜下观察并照相。大鼠海马CA区选择3个视野，计算各组大鼠海马神经细胞凋亡率。

2.6免疫荧光染色观察LC3颗粒 常规石蜡切片、脱蜡，3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，高温柠檬酸盐缓冲液抗原修复，加完 I 抗LC3(1∶100；Abcam，Ab192890)后于4 °C湿盒中孵育过夜。PBS清洗3次，滴加稀释好的荧光(CY3)标记羊抗兔IgG(1∶100；武汉博士德生物工程有限公司，BA1032)，滴加DAPI对标本进行染核，荧光显微镜下观察采集图像，Image-Pro Plus 6.0半定量LC3的表达。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示多组样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠复苏前后基本生理参数和相关指标

各组大鼠在CA前体重、心率和平均动脉压等的差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠复苏前后基本生理参数情况

2 各组大鼠不同时点的NDS评分

CA/CPR组各时点的NDS评分较对照组明显降低(P<0.05)，提示CA/CPR组复苏后神经功能下降，存在脑组织损伤；而RIPostC组的NDS评分增高(P<0.05)，提示远程缺血后处理可改善神经功能，见表2。

表2 各组大鼠不同时点NDS评分比较

Table 2.Comparison of NDS scores of the rats in different groups at different time points (Mean±SD.n=9)

Group12 h24 hSham78.9±1.180.0±0.0CA/CPR49.8±3.4△57.1±4.7△RIPostC56.8±3.8*64.0±3.5*

△P<0.05νssham group;*P<0.05νsCA/CPR group.

3 自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的表达

与sham组比较，CA/CPR组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表达在ROSC后24 h明显升高(P<0.05);与CA/CPR组比较，RIPostC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表达在ROSC后24 h明显降低(P<0.05)，提示RIPostC抑制自噬相关蛋白的表达，降低细胞自噬水平，见图1。

4 神经细胞凋亡情况

TUNEL染色结果显示sham组凋亡细胞少见，凋亡率为(2.53±0.60)%；CA/CPR组可见较多凋亡细胞，凋亡率为(18.54±3.67)%；RIPostC组凋亡率为(9.78±1.60)%，较CA/CPR组显著降低(P<0.05)，见图2。

5 免疫荧光结果分析

对照组LC3颗粒形成较少，平均吸光度值为(3.88±0.72)%；CA/CPR组的海马神经细胞胞浆内可见明显LC3颗粒形成，平均吸光度值为(9.18±1.11)%；RIPostC组的平均吸光度值为(6.06±0.34)%，较CA/CPR组显著降低(P<0.05)，见图3。

Figure 1.Comparison of relative protein expression levels of LC3-II/LC3-I and beclin-1 in each group of the neural cells. Mean±SD.n=5.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

图1 各组神经细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1相对蛋白表达水平比较

Figure 2.Comparison of apoptotic rate of neural cells in each group (×400). Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

图2 各组大鼠神经细胞凋亡率的比较

Figure 3.Formation of LC3 particles in rat neural cells in each group (×400). Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

图3 各组大鼠神经细胞胞浆LC3颗粒形成

6 透射电镜结果

Sham组大鼠海马神经元内未见明显自噬体，线粒体外膜完整， 嵴光滑清晰可见， 基质均匀；CA/CPR组的神经元内可见较多自噬泡(黑色箭头所示)，线粒体体积缩小， 嵴紊乱、粗糙，基质浓缩；RIPostC组神经元内自噬泡较少(黑色箭头所示)，线粒体体积略有缩小， 嵴可分辨，基质浓度略不均匀，见图4。

Figure 4. Autophagosome and mitochondrial ultrastructure of hippocampal neural cells in each group (×5 000).

图4 各组大鼠海马神经细胞自噬体和线粒体超微结构

讨 论

心脏停搏是严重危害人类健康与生存的急危重症之一，尽早恢复血液灌注是治疗心跳骤停最有效的措施，然而脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤[1]。复苏后脑损伤是心跳骤停患者恢复自主循环后期死亡和致残最主要的原因[2]。远程缺血处理是目前研究较为广泛的一种内源性神经保护策略，因其简单方便，可操作性强，具有较好的临床应用前景。在这项研究中，笔者发现远程缺血后处理可改善复苏后神经功能，并降低复苏后的海马神经细胞凋亡，是一种有效的脑保护策略，这与许多研究结果一致[3-5]，然而其机制仍不清楚。

自噬是真核细胞的一种自我保护机制，通过对长半衰期蛋白及细胞器的降解和再利用来满足细胞代谢的需要，对维持细胞内稳态具有重要作用[6-7]。LC3定位于自噬体内外膜，参与自噬体的形成。其有 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ 2种存在形式，自噬发生时，LC3-Ⅰ经泛素样加工修饰并与自噬膜表面的脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ被通常用作检测哺乳动物自噬活性的重要指标[8]。在生理状态下，beclin-1与Bcl-2紧密结合，而缺血缺氧时，beclin-1与Bcl-2分离并参与自噬体的形成以及调节其它自噬蛋白在自噬前体膜的定位，其表达水平与细胞自噬水平正相关，是调控自噬的重要靶点[9]。近期研究表明适当自噬可以保护细胞，而自噬过度激活时，可引起自噬性细胞死亡。Shi等[10]在缺氧缺糖的体外细胞实验中证明过度的自噬可导致神经细胞的死亡；Cui等[11]在心跳骤停的动物模型上验证了自噬的激活介导复苏后期海马神经细胞死亡。因而我们推测远程缺血处理的保护机制可能与抑制复苏后脑海马组织的自噬有关。

本研究用Western blot、免疫荧光和透射电镜的方法来判断大鼠心肺复苏后神经细胞自噬水平的变化。研究结果显示，ROSC后24 h大鼠脑海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表达相比sham组明显增加，免疫荧光检测提示海马神经细胞胞浆LC3颗粒形成增多，透射电镜检查可看见神经元出现明显的自噬泡，提示神经细胞存在自噬水平的激活，而RIPostC组降低了自噬相关蛋白的表达，减少LC3颗粒形成，提高心肺复苏后大鼠NDS评分，说明RIPostC组抑制了脑海马组织的自噬水平，减轻了神经细胞过度自噬而导致的脑损伤，这也进一步验证了我们的推测。远程缺血后处理的脑保护机制主要通过内源性的神经和体液机制来实现。Zhou等[4]研究发现，这种处理方式可以通过抑制线粒体通透性转换孔的开放来实现脑保护作用。另外2项研究表明，这种处理方式可能通过减少氧化应激和炎症反应来发挥神经保护机制[12-13]。我们的研究主要从细胞自噬的角度进一步阐明了其内源性的神经保护机制。

综上所述，远程缺血后处理可以减轻心肺复苏后海马组织神经细胞凋亡，改善神经功能，这种保护作用可能与抑制脑海马神经细胞过度自噬有关，但调控自噬水平的具体分子机制有待进一步研究。