青蒿鳖甲方对二甲基苯蔥诱导雌鼠卵巢癌的影响及作用机制*

曹俊红， 姬 霞， 杜文霞， 孙 红

(河南省中医院, 河南中医药大学第二附属医院， 河南 郑州 450002)

目前，卵巢恶性肿瘤发病率较高，居妇科恶性肿瘤第3位，占人类整体恶性肿瘤5%。卵巢癌隐匿性较强，早期难发现，确诊时往往已处于中晚期，患者存活率仅为5%，严重威胁女性健康及生命安全[1]。随着现代中医的发展，选择传统中医方治疗各类肿瘤及探究其治疗机制，已成为医学研究的热点之一。青蒿鳖甲方首记于清代吴鞠通所著的《温病条辨》，由青蒿、鳖甲、地黄、知母和牡丹皮组成。研究证明[2]，青蒿可调节免疫效应，消炎抑菌；鳖甲抑制结缔组织增生，上调架蛋白表达和免疫力，延长抗体抗炎效应；知母、牡丹皮和地黄可抗过敏、解热和抗炎。青蒿鳖甲方可用于祛阴虚、除内热，已被用于治疗“癌热”，效果显著。本项工作通过在雌鼠卵巢进行原位埋二甲基苯蔥药线去建立卵巢癌动物模型，采取不同剂量青蒿鳖甲方干预卵巢癌雌鼠，探讨青蒿鳖甲方对雌鼠卵巢癌的治疗效果，分析其作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

同批次健康SPF级未孕雌性SD大鼠100只，3月龄，平均体重(200±20) g，由河南中医药大学第一附属医院实验动物中心提供，许可证号为SYXK(豫)2017-0001，本研究经医院实验中心动物伦理委员会批准。采取随机数表法将所有大鼠分为5组，每组20只，分为模型(model)组、青蒿鳖甲方高剂量(high dose)组、中剂量(medium dose)组和低剂量(low dose)组及西药(western medicine)组。

2 仪器与试剂

PCR扩增仪(上海宝予德公司)；MP-510电泳仪(Major Science)；倒置显微镜和冷冻自动切片机(Lecia)。BCA蛋白试剂盒(Invitrogen)；二甲基苯蔥(Sigma)；青蒿鳖甲汤(河南省中医院中药房，含青蒿，鳖甲，生地黄，知母，牡丹皮)；Bcl-2多克隆抗体、Bax多克隆抗体、AKT/p-AKT多克隆抗体、BTAK多克隆抗体和羊抗兔HRP标记Ⅱ抗(Santa Cruz)；免疫组织化学(SABC)试剂盒、Western blot裂解液和蛋白上样缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)。

3 方法

3.1卵巢癌雌鼠造模及分组给药 棉线浸入20%二甲基苯蔥+10%苯溶液后，静置40～50 min，待苯挥发后，调整棉线内二甲基苯蔥含量至0.5 mg/cm获取致癌药线。雌鼠腹腔注射麻醉后仰卧固定，下腹正中消毒后，于耻骨向上纵切开腹腔1.3～1.5 cm，完整暴露雌鼠腹腔内卵巢，分别将1根二甲基苯蒽致癌线缝入两侧卵巢，缝合腹腔，大鼠麻醉复苏后，继续分笼清洁级饲养，并行腹腔注射抗菌素预防感染。造模10 d后，断颈处死1只大鼠，卵巢上若出现0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm肿瘤则代表造模成功。造模成功后，各组大鼠行灌胃给药，模型组给予同体积生理盐水，高剂量组给予青蒿鳖甲汤3 g·kg-1·d-1，中剂量组给予青蒿鳖甲汤1.5 g·kg-1·d-1，低剂量组给予青蒿鳖甲汤0.75 g·kg-1·d-1，西药组给予美洛昔康4 mg·kg-1·d-1，连续给药6周。

3.2卵巢肿瘤组织形态学观察 各组雌鼠给药6周后取20只，处死，开腹取单侧卵巢(本研究随机选取左侧卵巢)，剥取瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型组瘤体重量-给药组瘤体重量)/模型组瘤体重量×100%。此外，取部分肿瘤组织，用4%甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(片厚约4 μm)，行常规HE染色，光镜下观察并摄片，剩余卵巢肿瘤组织-20 ℃冷冻备用。

3.3卵巢肿瘤组织Bcl-2和Bax免疫组化检测 采用EnVision免疫组化二步法，对各组雌鼠卵巢肿瘤组织石蜡切片常规脱蜡、水化，25 ℃下阻断切片内源性过氧化物酶，滴入枸橼酸盐45 ℃修复组织切片，分别滴入Bcl-2多克隆抗体(浓度1∶200)、Bax蛋白多克隆抗体(浓度1∶250)25 ℃下孵育1 h，滴入羊抗兔HRP标记II抗25 ℃下孵育30 min，DAB染色、苏木晴复染、脱水，透明后封片，于光镜下观察计数Bcl-2和Bax阳性细胞率，阳性细胞率(%)=阳性细胞/视野内总细胞×100%，每个切片计数10个视野，计算平均值，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，阳性细胞标准：细胞核呈棕色或棕褐色。

3.4卵巢肿瘤组织AKT、p-AKT和BTAK蛋白Western blot法测定 取冷冻卵巢肿瘤组织解冻后，切取约3 g，剪碎、研磨、滤网过滤，3 200 r/min离心5 min，静置30 min弃上清液，获得下层细胞液置于含10%胎牛血清DMEM(高糖)培养液中，于37 ℃、5% CO2下培养4 d，PBS洗10 min，胰酶消化、重悬，1 100×g离心，弃上清液，倒入蒸馏水，滴入细胞裂解液，1 100×g离心10 min，取上清液，BCA法定量蛋白质，取30 μg蛋白上样、电泳、PVDF膜转印，加入AKT、p-AKT、BTAK和GAPDH I抗、羊抗兔HRP标记II抗，以GAPDH为内参照，测定灰度值，计算灰度系数比，实验操作均根据实验试剂盒说明书执行。

3.5卵巢肿瘤组织AKT和BTAK mRNA水平测定 取冷存卵巢肿瘤组织解冻后，参照方法3.4获得细胞，按照TRIzol®Reagent试剂盒说明书操作提取总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用。用Bio-Rad MJ mini型荧光PCR仪(Bio-Rad)测定AKT和BTAK mRNA表达，所有引物由武汉塞维尔公司合成，引物序列如下：AKT的上游引物序列为5’-TTTATTGGCTACAAGGAACG-3’，下游引物序列为5’-AGTCTGAATGGCGGTGGT-3’，扩增长度213 bp；BTAK的上游引物序列为5’-GCTGGAGAGCTTAAAATTGCAG-3’，下游引物序列为5’-TTTTGTAGGTCTCTTGGTATGTG-3’，扩增长度243 bp；β-actin的上游引物序列为5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’，下游引物序列为5’- CTGTGCCGTTGAACTTGC-3’，扩增长度140 bp。RT-qPCR测定各目的mRNA表达最终采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

4 统计学处理

选择SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料选择均数±标准差(mean±SD)表示，多组计量资料分析选择单因素方差，组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组雌鼠卵巢瘤重和抑瘤率

高剂量组、中剂量组和西药组瘤重显著小于模型组瘤重(P<0.05)；高剂量组瘤重显著小于低剂量组瘤重(P<0.05)。各组雌鼠卵巢癌抑瘤率与青蒿鳖甲方呈现剂量依赖性上升(P<0.05)，见表1。

表1 各组雌鼠卵巢瘤重和抑瘤率

Table 1.Ovarian tumor weight and tumor inhibition rate of female rats in each groups (Mean±SD.n=20)

GroupOvarian tumor weight (g)Inhibition rate(%)Model8.32±1.92-High dose3.12±1.18**#46.34±4.42##Medium dose4.70±1.42*31.21±3.81#Low dose6.29±1.3820.62±3.14Western medicine4.72±1.44*29.72±3.72#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

2 各组雌鼠卵巢肿瘤组织形态学观察

模型组大鼠卵巢肿瘤组织内存在大量椭圆形肿瘤细胞，细胞核呈现深蓝色，胞质饱满；高剂量组、中剂量组和西药组肿瘤组织内肿瘤细胞出现萎缩、凋亡，肿瘤细胞数量减少，细胞间隙扩大，高剂量组肿瘤细胞最少，有片状肿瘤坏死区；低剂量组肿瘤组织内凋亡细胞较少，仍存在相当数量肿瘤细胞，见图1。

Figure 1.Histomorphological changes of ovarian tumors in female rats of each group (HE staining).

图1 各组雌鼠卵巢肿瘤组织形态学变化

3 各组雌鼠卵巢肿瘤组织Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞率

光镜下，模型组卵巢肿瘤组织视野内存在大量Bcl-2阳性细胞和少量Bax阳性细胞，细胞核呈现棕色和黄色；高剂量组视野内肿瘤组织内Bcl-2阳性细胞明显少于中剂量组、低剂量组和西药组，Bax阳性细胞明显多于中剂量组、低剂量组和西药组，见图2。统计阳性表达率得出，高剂量组Bcl-2阳性细胞率显著低于中剂量组、西药组、低剂量组和模型组(P<0.05)；高剂量组Bax阳性细胞率显著高于中剂量组、西药组、低剂量组和模型组(P<0.05)，西药组和中剂量组的Bcl-2和Bax阳性细胞率比较差异无统计学意义(P>0.05)；西药组和中剂量组的Bcl-2阳性细胞率低于低剂量组，Bax阳性细胞率高于低剂量组(P<0.05)，见表2。

4 各组雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT、p-AKT和BTAK蛋白表达

高剂量组、中剂量组、低剂量组和西药组雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT、p-AKT和BTAK蛋白表达显著低于模型组(P<0.05)；高剂量组AKT、p-AKT和BTAK蛋白表达显著低于中剂量组、低剂量组和西药组(P<0.05)；中剂量组和西药组AKT、p-AKT和BTAK蛋白表达显著低于低剂量组(P<0.05)，见图3、表3。

表2 卵巢肿瘤组织Bcl-2和Bax蛋白阳性表达率

Table 2.Positive expression rates of Bcl-2 and Bax protein in ovarian tumors (Mean±SD.n=20)

GroupBcl-2 positive cell rate (%)Bax positive cell rate (%)Model62.39±6.1310.31±3.42High dose12.28±4.19**##51.72±4.29**##Medium dose29.62±4.96**#26.19±4.22**#Low dose46.75±5.89*19.75±3.57*Western medicine28.71±4.88**#25.60±4.17**#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

Figure 2.Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax proteins in ovarian tumors of female rats in each group.

图2 各组雌性鼠卵巢肿瘤组织中Bcl-2和Bax的免疫组化染色

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

5 各组雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT和BTAK的mRNA表达

结果显示，高剂量组、中剂量组、低剂量组和西药组雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT和BTAK mRNA表达显著低于模型组(P<0.05)；高剂量组AKT和BTAK mRNA表达显著低于中剂量组、低剂量组和西药组(P<0.05)；中剂量组和西药组AKT和BTAK mRNA表达显著低于低剂量组(P<0.05)，见表4。

Figure 3.The protein expression of AKT, p-AKT and BTAK in ovarian neoplasm cells of female rats in each group.

图3 各组BTAK、AKT、p-AKT的Western blot图片

表4 雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT和BTAK mRNA表达

Table 4.The mRNA expression of AKT and BTAK in ovarian tumor cells of female rats (Mean±SD.n=20)

GroupAKT (%)BTAK (%)Model44.28±10.0855.62±9.85High dose11.55±7.85**##12.52±8.15**##Medium dose25.66±8.85**#24.85±9.05**#Low dose31.02±9.25*34.28±9.11*Western medicine27.35±9.08**#28.27±9.51**#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

讨 论

卵巢癌发生、发展及治疗机制多借助大鼠模型进行研究，存在多种雌鼠卵巢癌建模方式，其中包括二甲基苯蔥诱发卵巢癌变。研究表明[3]，二甲基苯蔥致雌鼠卵巢癌变过程漫长、多因素参与，其可使得卵巢组织癌变病理及肿瘤分子形成机制相似于人类卵巢肿瘤。本研究通过在雌鼠卵巢进行原位埋二甲基苯蔥药线的方法，使得二甲基苯蔥从卵巢上皮细胞渗透或通过线伤进入卵巢组织细胞，直接引起细胞恶性转变，生成致癌因子，同时已恶变的卵巢细胞还可释放多肽因子，刺激细胞分裂，并诱导周围正常细胞恶变。雌鼠卵巢经埋二甲基苯蔥药线建模后，埋线处出现卵巢肿瘤，卵巢癌雌鼠肿瘤组织出现大量椭圆形恶化细胞，与查付琼等[4]研究相符，反映出二甲基苯蔥对卵巢组织癌化毒性。

青蒿鳖甲方主要成分为青蒿和鳖甲，青蒿芳香质轻，透邪外达，鳖甲品情性善[5]，养阴入络别邪，二者均可入卵巢“阴”，搜“癌”邪，引邪出表。药理学研究证明[6]，青蒿可调节生物体免疫效应，消除炎症反应，抑制感染菌增殖；鳖甲可抑制结缔组织增生，增加机体内架蛋白表达和免疫力，促进抗体长时间抗炎效应。研究证实，青蒿鳖甲方能够改善肺癌大鼠肿瘤低氧微环境，抑制肿瘤炎症反应[7]，由此可推断青蒿鳖甲方能够在一定程度抑制或缓解二甲基苯蔥诱导产生的卵巢肿瘤生长。本研究结果显示，卵巢癌雌鼠经青蒿鳖甲方灌胃后，肿瘤组织内肿瘤细胞出现萎缩、凋亡，各组雌鼠卵巢瘤抑瘤率与青蒿鳖甲方剂量呈正相关，说明青蒿鳖甲汤能明显延缓雌鼠卵巢肿瘤细胞生成，促进肿瘤细胞凋亡，且干预效果与使用剂量存在联系，这可能因为肿瘤具有“阴虚内热”，中医特征即“癌热”，癌热由肿瘤组织低氧、酸中毒、炎症反应和免疫细胞活化等代谢应激反应产生，而青蒿鳖甲汤具有清邪伏火特征，可消除“癌热”。

为进一步了解青蒿鳖甲汤抑制雌鼠卵巢肿瘤的作用机制，我们分别观察了各组雌鼠卵巢肿瘤组织内Bcl-2阳性细胞和Bax阳性细胞分布情况。细胞凋亡受bcl-2和bax等基因调控，前者具有抗细胞凋亡作用，后者具有促细胞凋亡作用[8]。研究表明[9]，正常细胞周期呈现Bcl-2低表达和Bax高表达，Bcl-2蛋白与Bax蛋白动态平衡可以调节细胞正常凋亡。本研究对卵巢肿瘤细胞进行光镜观察可见，卵巢肿瘤组织视野内存在大量Bcl-2阳性细胞和少量Bax阳性细胞，细胞核呈现棕色和黄色，经青蒿鳖甲汤干预后，肿瘤组织内Bcl-2阳性细胞明显减少，Bax阳性细胞明显增多。统计学结果也显示，青蒿鳖甲汤治疗后卵巢癌肿瘤组织内Bcl-2阳性细胞率显著低于模型组(P<0.05)，表明青蒿鳖甲汤能够下调卵巢癌肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，这可能与青蒿鳖甲汤通过改善机体免疫功能，调控肿瘤细胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白平衡，促进肿瘤细胞凋亡有关。

AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，可调节细胞增殖、活性及凋亡[10]，在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信号通路中处于核心地位，其可被直接磷酸化，激活成为转录因子p-AKT，磷酸化下游底物[11]，实现对肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移的调控，促进肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡。研究表明[12]，激活的AKT可通过磷酸化作用调控下游靶蛋白Bcl-2和Bax等诱发细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究结果显示，青蒿鳖甲汤治疗后雌鼠卵巢肿瘤细胞AKT和p-AKT蛋白表达及AKT mRNA表达均显著降低，说明青蒿鳖甲汤能够降低卵巢肿瘤组织内AKT表达，下调蛋白Bcl-2表达，上调Bax蛋白表达，促进细胞凋亡。此外，本研究还显示，青蒿鳖甲汤治疗后雌鼠卵巢肿瘤细胞BTAK蛋白及mRNA表达显著低于模型组，由于BTAK是一个Aurora激酶家族的重要成员，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子组成为403个氨基酸残基，可通过参与细胞有丝分裂，影响恶性肿瘤的形成[12]，由此提示青蒿鳖甲汤能够降低卵巢肿瘤组织内BTAK蛋白mRNA表达，抑制卵巢肿瘤细胞有丝分裂进程，阻断卵巢恶性肿瘤生长，实现抗肿瘤效果。

综上所述，青蒿鳖甲方能抑制二甲基苯蔥诱导雌鼠卵巢癌肿瘤细胞增殖，使用剂量越高，抑癌效果越明显，其抑癌机制可能为通过降低AKT表达调控卵巢肿瘤细胞Bcl-2及Bax蛋白平衡和降低BTAK蛋白抑制卵巢肿瘤细胞有丝分裂。