授粉方法对克服菊科近缘属杂交受精前障碍的影响

聂梅，张红，冯雁梦，牛颜冰，吕晋慧

(1.山西农业大学林学院，山西 太谷 030800；2.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030800)

太行菊属作为菊科菊蒿亚族植物[1]，仅包括太行菊(Opisthopappustaihangensis)和长裂太行菊(Opisthopappuslongilobus)两个种，均可分泌芳香物质，尤以长裂太行菊为佳，将其与菊属品种杂交有可能获得具有芳香味的菊花新品种，对于濒危种质资源的保存和应用意义重大.菊花是高度杂合的异源多倍体，且为异花授粉植物，菊科不同属间天然杂交现象时常发生，使得菊花自交亲和性差、结实率低[2-3].授粉后，花粉萌发及花粉管生长是否正常是衡量杂交亲本是否存在受精前障碍的重要标志之一[4].近年来，研究者们使用多种授粉方法克服属间及种间杂交障碍，如李辛雷等[5]采用的混合花粉授粉法，陈琼等[6]使用的切割柱头授粉法，王旭等[7]用硼酸处理柱头等法均可提高芍药的亲和指数；耿兴敏[8]用盐水涂抹柱头增加了杜鹃杂交结实率.关于克服菊花受精前障碍方面，目前常用的方法有混合授粉、重复授粉、切割柱头以及花粉培养液等[9-10]，其中液体介质授粉法在不同品种菊花自交中应用较为广泛，但在菊科近缘属杂交中尚未见报道.因此，通过不同化学药剂处理柱头或花粉，是否增强异种柱头接受异缘花粉的能力，是克服菊科不同属间受精前障碍研究中亟待解决的问题.本研究将太行菊属长裂太行菊与地被菊‘赛牡丹’杂交，采用不同授粉方法处理花粉及柱头，探究其对太行菊属及其近缘属杂交后花粉附着、萌发及花粉管生长的影响，旨在为菊科不同属间品种远缘杂交提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为2个菊科近缘属品种，长裂太行菊(2n=18)为野生种，‘赛牡丹’(2n=54)为自育品种.

1.2 试验方法

1.2.1 杂交方法 于9月中旬晴天10∶00～14∶00进行人工授粉，授粉前母本去雄，同时剪至可见Y型柱头(不能伤及柱头)，授粉后进行套袋隔离并做好标记.

1.2.2 授粉方法 以长裂太行菊(♀)ב赛牡丹’(♂)为亲本，以新鲜花粉直接授粉作对照.

液体介质授粉法：配制等体积的液体介质于4 ℃冰箱中保存，使用前混入新鲜花粉100 mg.授粉后0.5、1、2、4、8、12、24 h观察记录.液体介质为：

① 100 mg/L蔗糖；② 100 mg/L蔗糖+Ca2+(0.1、0.3、0.6 mg/L)；③ 100 mg/L蔗糖+硼酸(0.025、0.05、0.1 mg/L).

NaCl涂抹柱头法：2%、5%、8% NaCl分别处理柱头0.5、1、6、12 h，授粉后0.5、2、6、12、24 h观察记录.

1.2.3 荧光显微观察 授粉后于不同观察时间分别取5个花序，用FAA固定液(70%酒精∶冰醋酸∶福尔马林=90∶5∶5)固定，4 ℃下保存备用.观察时用1 mol/L氢氧化钠软化脱色7 h，蒸馏水冲洗3～4次，用含0.1 mol/L磷酸三钾的0.1%苯胺蓝溶液浸泡4 h，用甘油做雌蕊压片.在Olympus-BX61荧光显微镜下观察并拍照.统计花粉附着和萌发情况，并计算以下指标：

平均每柱头附着花粉数=附着花粉数/观察雌蕊数

平均每柱头萌发花粉数=萌发花粉数/观察雌蕊数

1.3 数据处理

应用Excel2010和SPSS19.0软件进行整理分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 不同液体介质对花粉附着和萌发的影响

2.1.1 以蔗糖为介质对花粉附着和萌发的影响 以蔗糖为介质授粉，柱头上花粉的附着数及萌发数均随着授粉后时间的增加呈现先增后减的趋势(图1).其中，授粉后1 h，100 mg/L蔗糖处理下花粉附着数为9.8粒，为新鲜花粉的4.08倍.授粉后1～4h，100 mg/L蔗糖处理下花粉附着数变化不大，授粉后8 h，100 mg/L蔗糖处理下花粉附着数高达15.5粒，显著高于新鲜花粉(P<0.05).超过8 h后，100 mg/L蔗糖处理下花粉附着数仍多于对照.

授粉后1～4 h，100 mg/L蔗糖处理下花粉萌发数均显著高于新鲜花粉(P<0.05)，授粉后8 h，花粉萌发量最多，为3.5粒，授粉后12、24 h，蔗糖及对照处理下花粉萌发量均为0.以蔗糖为介质授粉，花粉萌发均正常，花粉管生长粗且直(图4).

2.1.2 以Ca2+为介质对花粉附着与萌发的影响

不同浓度Ca2+授粉后花粉的附着数和萌发数均随着授粉后时间的增加呈现先升后降趋势(图2).其中，授粉后2 h，0.1 mg/L Ca2+处理花粉的附着数和萌发数分别为8.1粒、3.6粒，显著高于其他处理(P<0.05)，比对照提前6 h达到最大值，授粉超过4 h后，对照处理花粉的附着数及萌发数均显著高于其他处理(P<0.05).授粉后1 h，0.3 mg/L Ca2+处理附着的花粉数为5粒，显著高于对照和0.1 mg/L Ca2+处理，花粉的萌发数却显著低于后者(P<0.05)，且不同时间观察柱头上花粉的萌发数变化不大.不同时间观察0.6 mg/L Ca2+处理后花粉的附着数及萌发数均低于对照及其他处理.以不同浓度Ca2+为介质授粉，柱头上花粉量有所差异，花粉管正常生长(图4).

同一时间点不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).图1 以蔗糖为介质对花粉附着和萌发的影响Figure 1 Effect of sucrose on pollen attachment and germination

同一时间点不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).图2 以Ca2+为介质授粉对花粉附着与萌发的影响Figure 2 Effect of pollination with Ca2+ on pollen attachment and germination

2.1.3 以硼酸为介质对花粉的附着与萌发的影响 不同浓度硼酸授粉后花粉的附着数和萌发数均随着授粉后时间的增加呈现先升后降趋势(图3).其中，授粉后1～8 h内，对照处理柱头上附着量显著高于不同浓度硼酸处理(P<0.05)(图3-A).授粉后4 h，0.025、0.05 mg/L硼酸及对照处理附着数均达到最大值，分别为7.4粒、6.5粒、13.4粒，授粉后2 h，0.1 mg/L硼酸处理附着数为4.8粒，比其他处理提前2 h达到最值.

授粉后1 h，0.025 mg/L硼酸处理花粉的萌发数显著高于其他处理(P<0.05)(图3-B).授粉后2～8 h，不同浓度硼酸处理花粉的萌发数均显著低于对照(P<0.05)，授粉后12、24 h，各处理花粉的萌发量接近0.以不同浓度硼酸为介质授粉，花粉管萌发正常(图4).

2.2 不同浓度NaCl处理柱头对花粉附着与萌发的影响

由图5可知，不同处理花粉的附着数均随着NaCl浓度的升高而增加.同一浓度下，花粉附着数随着NaCl处理柱头时间的增加而降低，最佳处理时间为0.5 h.其中，不同浓度NaCl处理柱头0.5 h、1 h，不同时间观察，8%NaCl处理附着的花粉数显著高于其他处理(P<0.05).授粉后24 h，8% NaCl处理柱头0.5 h花粉的附着数高达32粒，分别为对照(新鲜花粉)、2% NaCl和5% NaCl处理的6.97倍、1.84倍、2.09倍.不同浓度NaCl处理柱头6 h，黏附的花粉数存在差异.授粉后6、12 h，2%、5% NaCl处理花粉的附着数显著高于8%NaCl处理(P<0.05)，授粉后0.5～12 h，8% NaCl处理附着数变化不大，授粉后24 h附着数达到最大值.

同一时间点不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).图3 以硼酸为介质授粉对花粉附着与萌发的影响Figure 3 Effect of pollination with boric acid on pollen adhesion and germination

A1～A4：100 mg/L 蔗糖授粉后0.5、1、2、8 h；B1～B2：0.1 mg/L、0.3 mg/L Ca2++100 mg/L蔗糖授粉后1 h；B3～B4：0.025 mg/L、0.05 mg/L硼酸+100 mg/L蔗糖授粉后1 h.A1～A4：0.5,1,2 and 8 h after pollination with 100 mg/L sucrose；B1～B2：0.1 mg/L,0.3 mg/L Ca2++100 mg/L sucrose for 1 h after pollination；B3～B4：0.025 mg/L,0.05 mg/L Boric acid +100 mg/L sucrose for 1 h after pollination.图4 不同液体介质对花粉附着及萌发的影响Figure 4 Effects of different liquid mediums on pollen adhesion and germination

A～D：不同浓度NaCl处理0.5、1、6、12 h后花粉的附着数；E～G：不同浓度NaCl处理0.5、1、6 h后花粉的萌发数.A～D: The adhesion number of pollen after treatment of 0.5,1,6 and 12 h with different concentrations NaCl；E～G: The germination number of pollen after treatment of 0.5,1 and 6 h with different concentrations NaCl.图5 不同浓度NaCl处理柱头对花粉附着与萌发旳影响Figure 5 Effects of different concentrations of NaCl treatment on pollen attachment and germination

随着授粉后时间的增加，不同浓度NaCl处理柱头相同时间，花粉萌发数变化趋势存在差异.其中，8%NaCl处理6 h，授粉后0.5 h，花粉的萌发数显著高于2%、5% NaCl处理及对照(P<0.05),不同浓度处理柱头12 h，花粉萌发数均为0.此外，不同浓度NaCl处理对花粉管的影响不同.其中，2%NaCl处理柱头0.5、1 h，花粉管顶端出现破裂、分叉现象，5%NaCl处理柱头0.5 h后，花粉管出现扭曲现象，8%NaCl处理柱头0.5 h后，花粉萌发正常，花粉管顶端未出现异常(图6).

A～C：2%、5%、8% NaCl分别处理柱头0.5、1、6 h后授粉.A～C:2%,5%,8% NaCl respectively deal with the stigma for 0.5,1,6 h before pollination.图6 不同浓度NaCl处理0.5、1、6 h后花粉的附着和萌发Figure 6 Pollen attachment and germination after different concentrations of NaCl treatment for 0.5、1、6 h

3 讨论

菊花是孢子体型自交不亲和植物，其雌蕊柱头为干性的，通常花粉粒被抑制部位出现在柱头上.授粉后花粉的黏附与萌发数量少、胼胝质过多沉淀、花粉管异常生长，均可导致杂交亲本产生受精前障碍，增加受精失败的概率.

3.1 液体介质授粉法对花粉附着和萌发的影响

适宜的糖分可改善干燥型柱头的湿润度和花粉的活力，花粉易萌发[9].糖类物质除了为花粉萌发提供营养外，同时还具维持外界环境的渗透压，以促进花粉管生长[11].邓盛斌[12]、徐芬芬等[13]认为，适宜的蔗糖利于花粉萌发和花粉管生长.罗凤霞等[14]发现，花粉培养液添加100 mg/L蔗糖对百合杂交结籽普遍有促进作用.以上研究与本试验结果基本一致，授粉后1～8 h，100 mg/L蔗糖可明显促进花粉附着和花粉萌发，且花粉管生长正常.孙春青等[15]在研究中发现，人工授粉后24 h，平均每柱头上萌发的花粉数量最多，这与本试验结果存在差异，授粉后8 h，长裂太行菊柱头上花粉附着量最大，超过8 h后，其花粉附着量仍多于对照，但花粉萌发数降为0，说明100 mg/L蔗糖可促进花粉附着，且促进作用持续较久.

Ca2+是花粉萌发和花粉管生长的关键物质，且外源钙可作为萌发时群体效应的替代因子[16].本研究发现，低浓度Ca2+明显促进花粉附着和萌发，高浓度Ca2+则表现出抑制作用.这与贾文庆等[17]、郑昀晔等[18]研究结论一致，外源钙可显著提高地被菊柱头上异缘花粉的萌发率.薛晓敏等[19]、储立民等[20]、姚成义等[21]研究发现，Ca2+主要影响花粉萌发、花粉管生长速度.本研究中不同浓度Ca2+处理后花粉管粗且直，但对于花粉管生长速度的影响有待深入研究.孙鹏等[22]发现授粉后2 h，授粉作用促使柱头胞外基质的钙含量增加，这与本实验结果一致，0.1 mg/L Ca2+授粉后2 h，明显促进花粉附着和萌发，随着授粉后时间的增加，促进作用减弱.在试验中还发现，0.3 mg/L Ca2+授粉后1 h促进花粉附着，但不利于花粉萌发，这可能是由地被菊柱头上存在的某种抑制物所致.

硼元素可增加氧的吸收，还可促进糖平衡，与糖结合能极大地提高花粉的萌发率，且利于花粉管的形成、萌发[23].迄今有关硼酸对花粉萌发的研究多数认为一定浓度的硼酸有利于花粉萌发和花粉管生长.蒋桂华等[24]发现，0.3 g/L硼酸促进草莓花粉萌发和花粉管生长.杜玉虎等[25]发现，0.02%硼酸可显著促进花粉萌发和花粉管生长.韩志强等[26]认为0.015 g/L硼酸处理后，枣花粉的萌发率最高.这与本试验结果并不一致，且硼酸浓度高于试验中的处理水平，0.025 mg/L硼酸授粉后1 h花粉萌发量显著多于对照，不同浓度硼酸授粉后0.5～24 h花粉附着量均低于对照，这可能与不同亲本花粉的内源硼含量有关.

硼离子是酯化果胶的主要成分，参与花粉管壁脱酯化过程，可增加花粉管壁的可塑性[27].外源硼利于花粉管形成及生长，这与试验中荧光显微观察的结果一致，不同浓度硼酸处理后花粉管正常生长，粗且直.

3.2 NaCl涂抹柱头法对花粉附着和萌发的影响

NaCl可破坏柱头表面的蛋白层，对异源花粉的排斥力下降，说明盐处理在一定程度上能克服受精障碍[28].本研究得出，不同浓度NaCl处理柱头，授粉后24 h内，对花粉附着及萌发均表现出不同程度的促进作用，但花粉管生长情况存在差异.安彩泰等[29]发现，10%NaCl溶液处理柱头后显著提高甘蓝型油菜的萌发率.罗凤霞等[14]认为，食盐水对花粉萌发的促进作用不稳定.耿兴敏等[8]、李建厂等[30]认为，0.3%与1.0%盐介质均对花粉萌发表现出显著的负效应.试验中发现，不同浓度NaCl处理柱头0.5 h，授粉后24 h，柱头上花粉附着量最高，但花粉的萌发量显著少于对照.由此可推断，花粉与雌蕊柱头相互识别作用的过程中，雌蕊柱头上可能存在抑制因子,阻碍了花粉的正常萌发，因而仅有较少花粉能够在柱头萌发.NaCl通过破坏柱头表面的乳突细胞，减少了胼胝质反应，达到了克服杂交障碍的作用[31].本研究中，随着处理时间的增加，不同浓度NaCl涂抹柱头均可抑制萌发，这是由于NaCl处理过久，致使乳突细胞出现萎蔫，影响柱头活性.试验中较低浓度(2%、5%)NaCl处理后花粉管出现扭曲、分叉现象，这与NaCl溶液克服自交不亲和的作用机理相悖[32]，可能是不同物种特性对NaCl的浓度要求不一.

4 结论

采用不同液体介质授粉，花粉附着数及萌发数授粉后24 h内呈现先增后减的趋势，100 mg/L蔗糖可显著促进花粉的附着和萌发.低浓度Ca2+(0.1 mg/L)促进花粉的附着及萌发，高浓度Ca2+(0.6 mg/L)则表现出抑制作用.0.025 mg/L硼酸对花粉萌发表现出一定的促进作用.授粉后24 h内，不同浓度NaCl处理柱头后，花粉附着及萌发及花粉管生长情况存在差异.高浓度(8%)NaCl处理柱头可显著促进花粉附着及萌发，且花粉管生长粗且直，低浓度(2%、5%)NaCl处理下花粉管出现分叉、扭曲等异常现象.

综上可知，采用不同授粉方法有利于克服太行菊属与菊属杂交受精前障碍，从一定程度上提高菊科近缘属杂交亲和性.一般认为,花粉内外源钙促进萌发的效果不如硼离子显著，但试验中硼酸对花粉附着及萌发的作用不如钙离子明显，是否受父母本正反交的影响，还有待深入研究.