小白菊内酯对胰腺癌细胞SW1990增殖、侵袭和迁移的影响

刘隽东 迟南南 徐建博 张天英 杨 义 汪凤山

(佳木斯大学附属第一医院1 药剂科，2 消化二科，3 重症医学科，黑龙江省佳木斯市 154002，电子邮箱：liujundong19831@163.com)

胰腺癌是一种较难治愈的恶性肿瘤，近年来其患病率逐年升高[1]。由于胰腺癌临床症状不明显，起病隐匿，疾病早期无明显体征，因此，多数患者确诊时疾病已发展至中晚期，手术切除率较低，导致预后较差，5年生存率极低[2]。另外，术后肿瘤的转移和局部复发也是胰腺癌治疗失败或导致死亡的原因之一[3]。寻找胰腺癌新型综合治疗手段，改善患者预后，成为目前研究的热点。小白菊内酯(parthenolide，PTL)是提取自菊科植物小白菊的一种倍半萜内酯类物质，具有减轻头痛、缓解炎症等功效，临床上多用于治疗风湿、偏头痛等疾病[4]。近年研究表明，PTL与伏立诺他联用可显著抑制乳腺癌MDA-MB231细胞的增殖，并诱导其凋亡和自噬[5]。Yu等[6]发现，经PTL作用后，人口腔鳞癌细胞中含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3等凋亡相关蛋白表达上调，从而抑制口腔鳞癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。但PTL对胰腺癌细胞的影响尚不清楚。本研究采用不同浓度的PTL作用于人胰腺癌细胞系SW1990细胞，观察PTL对SW1990细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其机制，旨在探讨PTL应用于胰腺癌治疗的可能。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及主要试剂与仪器 人胰腺癌细胞系SW1990细胞(批号：TCHu201)购自中国科学院上海细胞库。PTL(纯度≥98%，批号：P0667-25MG)、反转录试剂盒(批号：HSRT100)、TRIzol试剂(批号：T9424)均购自美国Sigma公司；L-15培养基(批号：41300039)购自美国Thermo公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(批号：P0011)、蛋白提取试剂盒(批号：P0025)、细胞计数检测(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒(批号：C0037)、Transwell小室均购自上海碧云天公司；AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix(批号：R123-01)、胰蛋白酶(批号：25300054)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；羊抗兔IgG二抗以及兔源一抗周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗体、E-钙黏素抗体、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2抗体、MMP-9抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(批号：ab199728、ab76055、ab92536、ab73734、ab8245)均购自美国Abcam公司；酶标仪(型号：ELx800TM)、荧光定量PCR仪(型号：IQ5)、流式细胞仪(型号：CytoFLEX)均购自美国Bio-Rad公司；CO2细胞培养箱购自日本SANYO公司。

1.2 细胞培养及PTL干预浓度的筛选 复苏SW1990细胞，用含10%胎牛血清的L-15培养基培养，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中传代培养。取对数生长期的细胞，将SW1990细胞以5 000个/孔接种至96孔板。培养24 h后分别加入不同浓度的PTL(5、10、20、40、80 μmol/L)20 μL处理SW1990细胞，对照组加入等体积0.9% NaCl溶液。分别于干预12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，向各组细胞加入CCK-8溶液，继续培养2 h，离心收集SW1990细胞，采用酶标仪检测细胞在450 nm波长下的吸光度(A)值。计算不同浓度PTL对SW1990细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-APTL处理组/A对照组)×100%。每个浓度设置3复孔，实验重复3次。根据实验结果选取PTL干预细胞的适宜浓度。

1.3 细胞分组及干预 取对数生长期的细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×106个/孔接种至6孔板，培养至细胞融合度约80%时，根据1.2的实验结果将细胞分为对照组、10 μmol/L PTL组、20 μmol/L PTL组、40 μmol/L PTL组。对照组加入20 μL的0.9% NaCl溶液，其余各组加入相应浓度的PTL。每组设置6个复孔。

1.4 平板细胞克隆形成实验检测SW1990细胞增殖情况 干预48 h后，收集各组SW1990细胞，制备单细胞悬液，计数后接种至含有6 mL的L-15培养基的培养皿(每个培养皿含1 000个细胞)中，于37℃、5% CO2、90%相对湿度的培养箱中倒置培养。待长出肉眼可见的细胞克隆时(2～4 d)，取出并计数每个培养皿中细胞克隆数目，计算SW1990细胞克隆形成率。克隆形成率=(细胞克隆数目/1 000)×100%。每组实验重复6次。

1.5 划痕实验检测SW1990细胞迁移能力 干预48 h后，收集各组SW1990细胞，以1×106个/孔接种至6孔板，待细胞长满后，采用200 mL枪头于6孔板内侧垂直划痕，轻轻吸尽旧培养基，以磷酸缓冲液洗去划落的细胞，加入无血清L-15培养基，置于37℃、5% CO2、90%相对湿度的培养箱中常规培养。48 h后置于倒置显微镜下拍照，并比较0 h、48 h时，SW1990细胞划痕两侧的间距，依此评价SW1990细胞迁移能力，划痕间距=0 h划痕两侧的间距-48 h时划痕两侧的间距。每组实验重复6次。

1.6 Transwell实验检测SW1990细胞侵袭能力 PTL干预48 h后，收集各组SW1990细胞，加入无血清L-15培养基制作细胞悬液，接种于加有50 μL基质胶(2.0 mg/mL)的Transwell小室上层(3 000个细胞/孔)，按照文献[7]中的方法进行操作。小室风干后，置于500 μL的 0.1%结晶紫溶液中染色，于显微镜下拍照，统计迁移至Transwell下室的SW1990细胞数量。每组实验重复6次。

1.7 实时荧光定量PCR检测CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA表达 按1.3方法处理细胞48 h后，采用TRIzol法提取各组SW1990细胞总RNA，检测其浓度和质量，按照试剂盒说明书操作反转录合成cDNA。以GAPDH为内参基因，采用AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR，反应体系：10 μmol/L上下游引物0.5 μL，SYBR® Green Master Mix 5 μL，50 ng/μL cDNA 1 μL，无菌ddH2O 3.0 μL，总计10 μL。反应条件：95℃ 90 s；95℃ 30 s；62℃ 30 s；72℃ 20 s；40个循环。采用2-△△CT法计算CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量。引物均由上海生工生物公司合成，序列见表1。

表1 CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9及GAPDH引物序列

1.8 蛋白免疫印迹法检测CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平 按1.3方法处理细胞48 h后，采用蛋白裂解液裂解SW1990细胞，提取细胞总蛋白并测定蛋白总质量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后进行转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入兔源一抗CDK4抗体、E-钙黏素抗体、MMP-2抗体、MMP-9抗体、GAPDH抗体(1 ∶500)，4℃孵育作用过夜；加入二抗羊抗兔IgG(1 ∶4 000)，室温孵育1 h。采用化学发光试剂处理后，经Tanon软件拍摄图像并进行半定量分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用行LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTL对SW1990细胞增殖的影响 PTL干预细胞36 h后，与对照组相比，各干预时间点，10、20、40 μmol/L PTL均能抑制细胞增殖，见图1。干预48 h后，PTL对SW1990细胞的半数抑制浓度为(37.15±2.34)μmol/L。

图1 不同时间点不同浓度PTL干预下SW1990细胞增殖抑制率

2.2 PTL对SW1990细胞平板克隆形成、迁移能力、侵袭能力的影响 对照组、10 μmol/L PTL组、20 μmol/L PTL组、40 μmol/L PTL组SW1990细胞克隆形成率及侵袭能力依次降低，划痕间距依次增大(均P<0.05)，见表2及图2～3。

表2 PTL对SW1990细胞平板克隆形成、迁移能力、侵袭能力的影响(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与10 μmol/L PTL组比较，#P<0.05；与20 μmol/L PTL组比较，DP<0.05。

图2 各组SW1990细胞的迁移能力

图3 各组SW1990细胞的侵袭能力

2.3 PTL对SW1990细胞CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响 PTL作用48 h后，对照组、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L PTL组SW1990细胞CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白相对表达水平均依次降低(均P<0.05)，见表3～4及图4。

图4 SW1990细胞CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况

表3 各组SW1990细胞CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达水平比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与10 μmol/L PTL组比较，#P<0.05；与20 μmol/L PTL组比较，DP<0.05。

表4 各组SW1990细胞CDK4、E-钙黏素、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与10 μmol/L PTL组比较，#P<0.05；与20 μmol/L PTL组比较，DP<0.05。

3 讨 论

胰腺癌是恶性程度较高的恶性肿瘤，其发生与高脂饮食、遗传及环境因素有关，但具体发病机制尚不明确。目前外科手术是根治胰腺癌的唯一方法，然而由于胰腺癌的早期诊断困难，确诊时患者病情已发展至中晚期，错过手术机会，此时化疗是主要的治疗方式[8]。目前临床采用吉西他滨作为胰腺癌化疗的一线药物，但其毒副作用大且治疗效果不佳[9]。因此，寻找有效、安全的胰腺癌治疗药物具有重要意义。胰腺癌SW1990细胞系源自一名Ⅱ期胰腺腺癌患者，已被广泛应用于胰腺癌的研究[10]。本研究结果显示，PTL干预SW1990细胞36 h后，各干预时间点，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L PTL均能抑制胰腺癌细胞系SW1990细胞的增殖，而干预48 h后，PTL对SW1990细胞的半数抑制浓度为(37.15±2.34)μmol/L，故本研究选择10、20、40 μmol/L PTL干预SW 1900细胞为48 h。

PTL是分离自菊科植物小白菊等的一种天然倍半萜内酯类物质，具有抑制炎症、抗肿瘤等药理活性[11]。Kim等[12]发现，PTL可通过上调结直肠癌细胞的促凋亡蛋白的表达，如p53细胞色素等，促进结直肠癌细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用。本研究结果显示，对照组、10 μmol/L PTL组、20 μmol/L PTL组、40 μmol/L PTL组细胞的克隆形成率均依次降低(均P<0.05)，提示PTL可抑制人胰腺癌细胞增殖能力，具有抗肿瘤作用，且呈一定的剂量依赖性。

细胞是人体的基本组成单元，细胞增殖是一个多基因协同调控的过程，哺乳动物的细胞生长周期分为G1、S、G2、M 4个时期，其中G0/G1期的正常启动是细胞周期正常增殖的关键[13]。细胞接到信号后，在生长因子等的持续作用下，激活一系列信号通路，CDK4/6作用于受体结合域蛋白，使其磷酸化，进而作用于下游目标蛋白，促使细胞由G1期进入S期，开始染色体的复制，完成有丝分裂过程[14-15]。本研究中，各浓度PTL组SW1990细胞CDK4 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组，且呈剂量依赖性(P<0.05)，提示PTL对SW1990细胞增殖的抑制作用可能与抑制CDK4蛋白表达有关。

肿瘤的发生由多因素共同参与，疾病过程复杂，当机体受到致癌物刺激后，单一细胞基因表达失调，导致细胞增殖异常，侵袭能力增加，呈浸润式生长，引起癌变[16]。本研究中，各浓度PTL组SW1990细胞划痕的间距大于对照组、侵袭至Transwell下室的细胞数量少于对照组(均P<0.05)，提示PTL可抑制人胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤发生远端转移的病理状态，主要表现为失去上皮细胞特性而具有肌成纤维细胞特性[17]。在细胞发生EMT过程中，上皮细胞标志物，如E-钙黏素表达减少，间充质标志物，如α-平滑肌动蛋白表达增加，细胞间的黏附作用降低[18-19]。MMP-2和MMP-9属于Ⅳ型胶原酶原，对细胞外基质的降解具有重要作用[20]，与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。本研究中，PTL各处理组SW1990细胞E-钙黏素、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白相对表达水平均低于对照组，且呈剂量依赖性(P<0.05)。提示PTL可能通过抑制SW1990细胞上皮细胞标志物E-钙黏素蛋白及侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达，从而抑制人胰腺癌细胞迁移和侵袭。

综上所述，PTL可能通过调控CDK4、E-钙黏素、MMP-2及MMP-9等蛋白的表达，从而抑制人胰腺癌细胞系SW1990细胞的增殖、迁移和侵袭，以发挥抗肿瘤的作用。