酿酒小曲中功能微生物的研究进展

王春晓，唐佳代，吴鑫颖，周鸿翔，邱树毅*

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

酒曲是以粮食为原料制成的糖化发酵剂，酒曲中微生物资源丰富，为发酵食品生产所需的酶提供稳定的来源。传统酒曲多采用自然接种和开放式培养的方式，品质不易控制且存在食品安全隐患。将功能微生物应用于酿酒与食品生产[1]，是相对于传统工业生产更安全、高效和环保的技术方法。因此，酒曲中功能微生物的筛选和应用成为了科学研究和工业生产共同关注的焦点。小曲是我国四大酒曲之一[2]，其应用广泛，但目前对于小曲及其中功能微生物的研究报道较少。本文着重对酿酒小曲中的功能微生物筛选、应用的研究进展进行综述，以期为功能微生物科学研究和工业化应用提供参考。

1 酿酒小曲简介

1.1 酿酒小曲的定义和分类

酿酒小曲多以大米、米糠、麸皮和谷类为原材料，部分加有中草药[3]，是经人工接种曲母或根霉、酵母菌培养而成的微生物制剂[4]，因曲块体积小而得名。小曲被称为白药、酒饼、白曲、酒药、药曲、酒曲丸等。小曲主要用于生产甜米酒、黄酒、米香型白酒、清香型白酒和豉香型白酒[5]，具有很多不同种类（表1）：根据最终发酵成酒的类型，小曲可以分为白酒小曲、甜酒曲和黄酒小曲；根据不同的生产地区，小曲可分为广东和广西生产米香型白酒的小曲、贵州生产固态法白酒的药小曲、江苏和浙江生产黄酒及甜酒的酒药等[3]。此外，根据成品曲形态、原料和中草药添加等的不同，小曲还可分为其他不同类别（表1）。韩国的Nuruk和日本的Koji是类似于小曲的发酵剂，其中Nuruk是以未蒸煮大米、大麦、玉米和大豆等谷物为原料，接种霉菌、酵母和细菌制成的米酒发酵剂[6]，而Koji是将纯种微生物接种于蒸熟的大米或大豆中制得的发酵剂[7]。

表1 酿酒小曲的分类Table 1 Categories of Xiaoqu

1.2 酿酒小曲的来源和发展历史

古代酒曲的发展历史时间轴如图1所示。周代的《尚书·说命下》中记载到“若作酒醴，尔惟曲蘖”，当时用于酿酒的酒曲均为散曲；《楚辞》中有记载春秋战国时期“吴醴白蘖，再宿为醴”，其中的白蘖意为白米之曲，以稻米为原材料的小曲此时初步形成[8]；汉代人们先制散曲，在散曲基础上制成块状曲[2]；北魏时期的《齐民要术》总结了9 种酒曲的制作工艺，尤其是利用“曲范”模具将曲块加工成型，改进了原来手工捏制成型的工艺。此外，北魏时期人们开始制作药小曲；药小曲制曲工艺在晋代发展成熟，人们将草药汁加入由大米捣碎而成米粉中，制成卵状放置于蓬蒿中一个月成曲；唐代为节省曲房空间，将散放酒曲改进为堆放，称为堆曲，并沿用至今；发展到宋朝时酒曲制作工艺已经完善，人工接种技术开始应用，而中草药广泛用于制作酒曲；到了元、明、清时期，更多的中草药被应用在小曲的制作中，使药小曲的制作工艺得到了进一步的发展[2]。

图1 酿酒小曲发展时间轴Fig. 1 Developmental timeline of Xiaoqu

1.3 酿酒小曲的现代制作与应用方式

相对于传统工艺，酿酒小曲的现代制作工艺主要发展了麸皮制曲、纯种制曲、加酶小曲和机械化制曲等方式，在提高糖化力和出酒率的同时降低了酒曲的使用量，节约了原料和人工成本，酒质也得到了提高[9]。酿酒小曲发展到现在，与功能微生物的应用是分不开的。一方面，功能微生物被制作成酿酒强化曲应用于工业生产，强化曲是将原料浸泡或翻炒后粉碎过筛，接种功能性微生物或纯种曲后加水拌匀并加工成型，经培养干燥制成的微生物制剂；另一方面可直接在酿酒过程中加入功能微生物。然而，现代酿酒小曲中引入最多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，对起酒化和酯化作用的功能酵母主要采用活性干酵母的形式引入，对影响风味的功能细菌则少有引入，在小曲进一步的发展中，尚需要对功能微生物的开发、工艺上合理应用及制曲机械自动化等方面开展更多深入的研究[9]。

在功能微生物的现代应用过程中，人们发现单一微生物曲酿造的产品质量稳定，但是风味复杂性及特性不明显，于是研究者开始探索多种功能微生物协同发酵的模式，如印度毛霉与米根霉协同发酵米酒[10]、纯种根霉曲与酿酒酵母按一定比例制作的强化甜酒曲[11]、黑曲霉与米曲霉混合制曲[12]、纯种酿酒酵母与传统小曲协同糖化发酵[13]等。添加中草药是制作酿酒小曲的一种传统方法，近年来有研究者将功能微生物引入药小曲，分析中草药与功能微生物之间的相互影响（表2）。据报道，中草药成分具有改善微生物营养、抑制杂菌、抗氧化等功能[14]。微生物代谢产生的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等酶类能够破坏中草药的细胞结构，将其降解为微生物可利用的糖和氨基酸等小分子物质[15]。研究表明，中草药对酵母的生长促进作用较大，其次是黑曲霉和黄曲霉，对根霉起作用的中草药材较少，而对细菌则主要起抑制作用[16]。

表2 中草药对酿酒小曲及功能微生物的作用Table 2 Effect of Chinese herbal medicine on Xiaoqu and functional microbes in it

2 功能微生物的研究现状

研究表明酒曲中的微生物主要为酵母菌、霉菌、细菌三大类[23]，通过糖化、酒化、产酯等作用影响成品酒的风味特性。通常将具有高糖化率、高产酯类、低产高级醇、高产蛋白酶等能力的微生物称为高活性菌株，即功能微生物。酿酒小曲中功能酵母菌主要有酒化、分泌芳香物质的作用；功能霉菌主要有分解淀粉等物质的作用；功能细菌主要有产生酸类物质协调酒体的作用。研究者根据菌株的发酵性能，筛选出功能菌株应用于发酵，使酒具有所需要的风格。目前，酿酒小曲中功能微生物的认识主要通过传统可培养方法分离获取，近年来随着组学技术的广泛应用，高通量测序技术被应用于小曲中微生物的多样性研究，结果发现了更丰富和复杂的微生物组成[24-25]，为更多功能微生物的工业应用提供了参考。

2.1 功能酵母的研究进展

酿酒小曲中的优势酵母菌为扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、汉逊酵母（Hansenulasp.）等[26]。酵母在发酵过程中会进行生长和存活所必需的初级代谢，主要代谢产物为乙醇、乙醛和乙酸等，次级代谢并非生长必需，主要产生高级醇、酯类、硫醇和萜烯类化合物等[27-28]。

酵母菌的酒化能力直接影响酒质和发酵效率，因此是功能酵母筛选的主要关注点之一。高产酒酵母多采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培养基鉴别法来筛选[29]，该方法通过肉眼观察菌落颜色深浅可初步判断其酒化能力，但不利于不同研究报道之间的对比性评价。研究者还可采用酒精计法或气相色谱法等检测乙醇含量，定量化的研究结果有利于所筛选高产酒酵母的功能评价和工业化应用。目前已报道的高产酒酵母如表3所示（未检测乙醇产量的研究不在其列），酿酒酵母作为主要酒化酵母，具有较强的乙醇产生能力，在发酵过程中主要通过糖酵解途径和乙醛途径产生乙醇（图2）。伍保龙等[30]从米酒酒曲中筛选到一株产酒能力强的酿酒酵母5-1Y，可将230 g/L葡萄糖溶液几乎完全发酵（糖利用率高达99.9%）产生13.16%酒精度（乙醇体积分数）。

酵母菌的产香能力对不同酒的风味特征形成起关键作用，作为不可忽视的风味物质，高级醇和酯类的产生主要由酵母生长不必需的次级代谢产生，其代谢途径如图2所示。

2.1.1 高级醇产生途径

图2 发酵过程中酿酒酵母产生乙醇、高级醇和酯类的代谢途径[28,31]Fig. 2 Metabolic pathways of ethanol, higher alcohols and esters in S. cerevisiae during fermentation[28,31]

酵母在发酵过程可通过2 种途径产生高级醇——氨基酸分解代谢途径即Ehrlich途径[31]（图2中红色箭头）和糖代谢合成途径（图2中蓝色箭头）。Ehrlich途径是发酵原料中的7 种不同氨基酸（图2）在转氨酶的催化下通过转氨作用合成相应的α-酮酸，α-酮酸脱羧形成醛，醛在脱氢酶的作用下进一步还原为相应高级醇。参与Ehrlich途径的酶主要包含氨基酸渗透酶（参与从原料中摄取亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）[32-33]、氨基酸转移酶（在线粒体和溶胶上起到催化氨基从氨基酸转移至α-酮酸的作用）[34]、脱羧酶（将α-酮酸脱羧形成相应的醛）和乙醇脱氢酶（将相应的醛还原为高级醇）[35-36]。研究证实，氨基酸通过Ehrlich途径产生高级醇的每一步反应都存在各种同工酶，主要是由于环境和营养条件的不同引起的，因此给相关酶身份和编码基因的鉴定提出了难题。如图2所示，多个基因参与Ehrlich途径相关酶的编码，但人们对这些基因所编码酶的认知尚不完全[31,37]。在氨基酸缺乏的情况下，Ehrlich途径无法进行，此时酵母可通过糖代谢合成途径产生高级醇：发酵原料中的葡萄糖通过糖酵解分解为丙酮酸，再进一步合成α-酮酸，或通过中间产物直接合成α-酮酸，α-酮酸经过与Ehrlich途径相同的脱羧和还原反应形成高级醇。

高级醇或称杂醇油是指碳原子数超过2的一元醇，主要包括正丙醇、异戊醇、异丁醇、活性戊醇、苯乙醇、酪醇、色醇和甲硫醇等[31,38]。高级醇是酒中重要的风味物质（如低浓度的苯乙醇呈花香风味[28]），但其含量过多会对神经系统造成伤害[39]，高级醇中己醇被列在有害物质数据库中[40]，异戊醇和异丁醇对人体毒性最大，酒精饮料中高级醇总量应小于10 g/L[38,41-42]。研究者们主要通过单倍体制备、菌种诱变、从自然界分离筛选等方式获取低产高级醇酵母，截至目前获取的低产高级醇酵母全部为酿酒酵母（表3）。郝欣等[43]筛选了一株高级醇产量为340.906 mg/L的酿酒酵母AY-15，并进一步通过分子育种获得高级醇产量更低的单倍体α-22（比亲本AY-15低12.46%）。王国正等[44]对筛选出的低产高级醇酿酒酵母菌株CF4进行常温常压等离子体诱变，获得了使正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别降低20%、19.4%和21.5%的诱变菌株酿酒酵母ARTP5。值得注意的是，使用不同的培养基会影响风味物质的形成[45-46]，因此表3列出的功能酵母相互之间的高级醇产量不具有可比性。

2.1.2 酯类产生途径

高级醇和乙醇是乙酸酯类化合物的前体物质[47]，原料中的氨基酸/葡萄糖经过Ehrlich途径/糖代谢合成途径产生高级醇；葡萄糖经过糖酵解途径和乙醛途径产生乙醇。作为前体物质，高级醇或乙醇都可进一步与乙酰辅酶A通过合成反应产生乙酸酯类化合物，前者生成乙酸高级酯（如乙酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸苯乙酯等）而后者生成乙酸乙酯[28]。如图2所示，该反应由ATF1和ATF2基因所编码的乙醇乙酰基转移酶催化合成[48-49]。此外，原料中的脂质通过代谢可产生中链脂肪酸，被辅酶A激活后可进一步与乙醇反应合成乙酯类化合物（丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等）[28]。该反应由EEB1和EHT1编码的酰基转移酶所催化（图2）[50]。

发酵过程中产生的乙酸酯类化合物主要呈现香蕉、苹果等香味特征，而乙酯类化合物呈现苹果、草莓、梨和茴香等香味特征[28]。发酵过程中产生的乙醇在含量和活性两方面均高于高级醇，因此乙酸乙酯是发酵过程中最常见的乙酸酯类化合物[28]，也是小曲酒的主体香成分之一[46,51]。由于酯类物质对酒体风味的重要作用，研究者对高产酯酵母十分关注，研究称汉逊酵母属、假丝酵母属、产朊酵母属和扣囊覆膜酵母等是酒中酯香的主要产生菌[52]，其中扣囊覆膜酵母还具有较强的淀粉酶活性[53]。目前通过自然分离和诱变育种，研究者获取的高产酯功能酵母如表3所示。李锐利[54]从白酒小曲中筛选出一株异常汉逊氏酵母，并将其应用到小曲酒的生产中，使乙酸乙酯含量提高了49.8%。王鹏昊等[55]从小曲中筛选到一株产酯量达2.684 g/L的异常威克汉姆酵母，其乙酸乙酯产量为2.481 g/L。

功能酵母菌可以同时具有低产高级醇和高产酯/酒的功能特征，目前获取的酵母菌多为酿酒酵母（表3）。王勇[29]从酒曲中分离得到了2 株高产乙酸乙酯、低产高级醇的酿酒酵母Y006和Y008，并分别制成强化曲应用在酿酒生产中，证明两者均有降低高级醇含量和提高乙酸乙酯含量及出酒率的作用。李维等[56-57]从酿酒酵母AY15的单倍体重组菌株中筛选低产高级醇和高产酯/酒的单倍体，并进一步杂交形成新的二倍体菌株AY15-BAT2＋ATF1和AY15-IAH1＋ATF1，2 株重组杂交菌在发酵高粱糖化液时同时表现了低产高级醇和高产酯的功能特征。

表3筛选的功能酵母大多已在实验室或中试条件下通过直接接种加入发酵醪的方式进行应用实验，结果证明功能酵母可以改善酒质或酒的风味，具有一定的应用价值[9,58]。杨强等[59]将功能酵母制备成麸皮种并按一定比例加入酒曲中，有效改善了小曲白酒的风味。魏浩林等[11]将功能酵母与纯种根霉曲按比例混合复配制成强化曲，提高了酒曲的发酵力和酯化力，为制作新型酒曲提供了思路。表3所示的21 株功能酵母中只有5 株分离自酿酒小曲，因此需进一步加强对酿酒小曲功能酵母的研究和工业应用。

2.2 功能霉菌的研究进展

功能霉菌在发酵过程中主要起糖化作用，即分离水解原料中的淀粉等大分子物质为葡萄糖。在厌氧条件下，一些霉菌还可进一步利用糖发酵产生乙醇（酒化作用）。除淀粉酶之外，功能霉菌还能产生蛋白酶、纤维素酶、酒化酶和单宁酶等[77]，在食品、酿造以及生物工程等产业中发挥重要作用（表3）。

表3 已筛选获取的功能微生物种类Table 3 Categories of functional microbes that have been obtained in the literature

2.2.1 淀粉酶

霉菌产生的淀粉酶有液化淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷转移酶等。液化淀粉酶（α-淀粉酶）主要由青霉和曲霉产生，能水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键，水解产物为短链糊精、寡糖、麦芽糖和葡萄糖，从而达到降低淀粉黏度（液化）的目的。糖化酶（α-1,4-葡萄糖水解酶）主要由根霉和曲霉产生，能将淀粉结构中的α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键切断，使绝大部分淀粉转化为葡萄糖[78]，为进一步发酵提供原料。酒曲中功能霉菌主要通过自然分离和菌种诱变的方式获取，其中高产淀粉酶菌株是目前主要的关注点（表3）。李江华等[67]从黄酒酒曲和酒药中分离到一株米曲霉A019，所产α-淀粉酶活力达410 U/g曲。

2.2.2 蛋白酶

蛋白酶主要由青霉和曲霉产生，分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。蛋白酶将原料中的蛋白质分解为氨基酸，氨基酸可进一步被酵母代谢，形成酒中重要的风味化合物——高级醇或酯。氨基酸还能在原料蒸煮过程中与还原糖发生美拉德反应产生风味物质[79]。酸性蛋白酶通过水解蛋白质，将一些与蛋白紧密结合的淀粉释放出来，从而为糖化发酵创造有利条件，因此高产酸性蛋白酶的功能霉菌也是目前的研究热点之一（表3）。尹永祺[69]从黄酒酒曲中分离到一株米曲霉DYT-30，不仅高产α-淀粉酶（68.6 U/g曲）和糖化酶（1 678.0 U/g曲），而且所产酸性蛋白酶活力达839.9 U/g曲。

2.2.3 其他酶类

一株霉菌可能产生多种酶类。研究人员曾从黄酒麦曲中分离到一株黑曲霉CF7，可分泌纤维素酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶和木聚糖酶[12]。除淀粉酶和蛋白酶外，霉菌分泌的其他酶类很多也对酿酒过程有益：纤维素酶主要由青霉和曲霉产生，纤维素酶的添加可以提高出酒率、减少高级醇含量、增加酯和酸含量[80]；根霉产生的酒化酶，在发酵过程中糖化的同时进行发酵，提高淀粉利用率[78]；一些曲霉和根霉可以产生单宁酶[81]，单宁酶能够将单宁水解为没食子酸和葡萄糖，没食子酸是一种具有抗氧化性的多酚，可促进酵母菌的生长，葡萄糖则被微生物所利用产生乙醇[81]；曲霉产生的酸性羧肽酶能够分解多肽，增加酵母的营养来源[82]；毛霉、根霉和曲霉产生的脂肪酶能将油脂水解为脂肪酸和甘油，并进一步通过三羧酸循环产生醇、酸和醛类物质，成为合成酯类的前体物质[83]。

表3所示的11 株功能霉菌中有8 株分离自酿酒小曲，说明人们对起糖化作用的功能霉菌的关注度高于功能酵母，然而，目前功能霉菌的研究多集中在淀粉酶和蛋白酶，对产其他酶类的功能霉菌分离筛选和研究相对较少（表3）。酿酒小曲中分离的功能霉菌大多被制备成纯种曲或进一步与其他纯种霉菌曲混合制成复合酒曲，以在工业生产中提高糖化力、改善酒质[10,69]。

2.3 功能细菌的研究进展

酒曲中的酵母和霉菌在发酵初期存在一段生长延迟期，此阶段细菌起着至关重要的作用：为发酵提供酸性的环境；产生蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、糖化酶和纤维素酶等酶类；酯化、促进美拉德反应和产生吡嗪类风味物质[74]。酒曲中功能细菌的研究如表3所示，目前已报道的功能细菌以芽孢杆菌居多，芽孢杆菌产生的中性蛋白酶能够降解原料中的大分子蛋白质，产生的酸性蛋白酶和淀粉酶可促进酒曲的糖化和液化，还可产生吡嗪类风味物质[74]。腾军伟等[1]从江米酒酒曲中分离的解淀粉芽孢杆菌GSBa-1具有分泌凝乳酶的功能，凝乳活力达431.53 SU/mL。但是，康宪[84]指出芽孢杆菌对甜酒曲中的根霉菌菌丝有明显的抑制作用。故在利用多种微生物协同发酵制作复合酒曲时，需考虑功能细菌相对功能酵母和霉菌的接种量，及其与其他微生物共接种时是否可协同发挥不同微生物的功能。

目前关于小曲中功能细菌的研究报道较少，表3所示的9 株功能细菌中只有1 株分离自酿酒小曲，要开发酿酒小曲中的功能细菌，需对不同酿酒小曲中的细菌进行系统性研究。由于功能细菌主要功能为产酸，无法同时满足酿酒所需的糖化和酒化功能，因此需要与功能霉菌和酵母菌协同使用。目前鲜有文献对酿酒小曲中筛选的功能细菌进行纯种发酵研究，大多在实验室通过直接加入的方式研究功能细菌在增加风味的同时是否会抑制霉菌糖化、酵母酒化、酯化及生长，如研究发现乳酸菌在与高产酯酵母共同使用时产生相互抑制的现象[85]。总之，目前对酿酒小曲中功能细菌的研究有限，需进一步开展相关应用实验，拓展功能细菌的应用价值。

3 结 语

近年来，酿酒小曲中功能微生物的研究取得了一些进展，但相对于大曲的研究仍存在一些不足：1）酿酒小曲中微生物的多样性研究受传统分离筛选方法的局限，目前关于小曲微生物资源的研究不够全面。在今后的研究中，需结合微生物组学技术对酿酒小曲中丰富的微生物资源进行全面挖掘[24-25]；2）酿酒小曲中研究较多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，对分泌其他酶类的霉菌、起酒化和酯化作用的功能酵母及影响风味的功能细菌少有报道。今后需在酿酒小曲中丰富微生物资源解读的基础上，加强对功能微生物的深入代谢研究和开发。也需加强对所开发的功能微生物的应用研究，目前功能霉菌主要通过制成纯种曲或复合强化曲的方式进行应用实验[10,69]，功能酵母主要采用直接接种或制成复合强化曲的方式进行应用实验[9,11,58-59]，而对于功能细菌的应用研究尚比较局限；3）酿酒小曲中不同种类功能微生物在发酵过程中的协同、拮抗和抑制作用是工业应用中不容忽视的问题，如酿酒酵母与乳酸菌共发酵产生的促进和抑制作用[85]、黑曲霉与米曲霉混合制曲对酶活力提高的协同作用[12]等，但目前关于功能微生物间相互影响机制的研究尚不多见[46]。Zhu Jing等[42]报道称，2 株地霉属菌株可降低成品白酒中高级醇含量并同时增加酯类含量，为功能微生物的创新性应用提供了新的思路。今后需在对功能微生物进行应用实验的同时研究不同种类微生物的相互作用，思考合理的应用方式，使霉菌、酵母和细菌能协同发挥作用。

随着食品生物技术的发展，越来越多的功能微生物正在改变酿酒方式，酿酒小曲中功能微生物的研究与开发具有很好的应用前景，需要得到更多的关注。高通量测序技术、基因编辑与重组技术和宏基因组等[86-88]现代分子生物学技术的应用，能够帮助人们快速了解酿酒小曲中微生物的多样性，促进更多功能微生物的挖掘，有利于分析与应用特定功能微生物的功能基因。未来，宏基因组学、宏转录组学和代谢组学等技术的综合利用可以帮助人们了解功能微生物间的相互作用，为在发酵过程中更好地应用酿酒小曲中的功能微生物产生高品质代谢产物提供基础。