精子DNA完整性对冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响

于鲁华，刘琳，吕芳，彭小彧，吕晓芹，赵一燕，张树红，张树成，王宁，张晓梅*

(1.大连医科大学，大连 116044；2.扬州大学，扬州 225001；3.江苏省苏北人民医院生殖医学中心，扬州 225001；4.广西医科大学，南宁530021；5.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081)

随着二胎政策的放开，不孕不育症的发病率不断上升，越来越多的人需借助辅助生殖技术(ART)如体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)来满足生育需求。既往研究更重视女性引起的不孕，但是在不孕不育病因中男性因素约占50%，且15%的男性不育患者精液常规检测结果正常[1]，精液常规分析仅能反映48%男性的生育能力，而精子DNA完整性检测可以有效补充传统精液分析的不足[2]。关于精子DNA完整性及不同水平精子DNA碎片率(DFI)下不同受精方式对IVF-ET妊娠结局的影响目前尚无统一定论。本研究回顾性分析2016年8月至2017年12月在江苏省苏北人民医院生殖中心接受IVF/ICSI助孕的667例不育夫妇的临床资料，探讨不同精子DFI及不同受精方式对冻融胚胎移植(FET)周期妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

以2016年8月至2017年12月在江苏省苏北人民医院我院生殖中心接受IVF/ICSI助孕的667对不育夫妇(女方667个周期)的临床资料为研究对象，包括IVF 419个周期、ICSI 248个周期。根据不同精子DFI水平将研究对象分为两组：低DFI水平组(低DFI组：DFI≤30%，439个周期)和高DFI水平组(高DFI组：DFI>30%，228个周期)；并根据不同的受精方式将两组再分为两个亚组：常规IVF组(IVF组)及ICSI组，比较不同水平精子DFI及在不同受精方式(IVF/ICSI)对FET周期妊娠结局的影响。

纳入标准：(1)单纯男方因素，包括性功能异常、轻中度少弱畸精子症、免疫因素等；(2)女方子宫形态及排卵无异常；(3)双方染色体无异常，无严重影响妊娠的内外科疾病。排除标准：(1)男性严重畸形精子症者；(2)女性患有子宫内膜异位症、子宫肌瘤、多囊卵巢综合征(PCOS)者；(3)因预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)、突发疾病、内膜因素等原因取消新鲜周期而行全胚冷冻者。

二、研究方法

1.精子DNA完整性检测：采集男方精液后，先用精子染色质结构分析法(Sperm chromatin structure analysis，SCSA)即利用吖啶橙染色质特异性来检测正常精子与DNA受损精子的方法[3]来处理精液样本，再将精液样本用400 μl酸化溶液(0.1%TritonX-100、0.15 mol/L NaCl、0.08 mol/L HCl配置，PH=1.2)处理，30 s后与1.2 ml染色缓冲液(6 μg/ml吖啶橙AO、37 mmol/L枸橼酸缓冲液、126 mmol/L磷酸氢二钠缓冲液、1 mmol/L EDTA、0.15 mol/L NaCl配置，PH=6.0)均匀混合，再放入FACS杯状流式细胞仪(Becton Dickinson，CA，美国)检测。为建立最佳的样本流场，在样本放置3 min左右进行AO染色，并通过FACS扫描和数据分析软件(DFIView 2010 Alpha11.15，CellProBiotech)对样本相关数据分析。

2.促排卵方案及IVF/ICSI：女方采用长方案促排卵：黄体中期采用GnRH-a降调节，降调节完成后在下次月经周期的第5天开始用外源性Gn诱发排卵，根据卵巢反应性调整药物剂量，直到HCG日停用GnRH-a。阴道B超下监测卵泡发育情况，当直径大于18 mm的卵泡数目≥2个时，当日21∶00左右予HCG(默克，瑞士)10 000 U肌肉注射，36 h后在B超引导下穿刺取卵。将取出的卵母细胞放置在培养箱中3～6 h，待其成熟后加入适量精液继续培养。ICSI操作：取卵后4～6 h将卵丘结构去除，选择见到极体的MⅡ卵母细胞进行显微镜下注射；体外授精l6～18 h后观察有无原核，40 h左右后观察卵裂情况，并选择可利用胚胎进行冷冻。

3.复苏周期：女方月经规律者采用自然周期准备内膜；月经异常者采用促排卵周期准备内膜：从月经周期第3天予以补佳乐(江苏恒瑞医药)口服，2 mg/次，bid，每隔3 d增加1 mg。于月经周期第12天，阴超下监测子宫内膜生长情况，当子宫内膜厚度≥8 mm时，用孕激素转化子宫内膜，为胚胎移植做准备，FET术后常规黄体支持。

4.临床妊娠判断：FET后14 d，检测受试者尿和血清β-HCG水平，若β-HCG>10 U/L，则为生化妊娠；移植后28～30 d后行超声检查，若见孕囊(含宫外妊娠)则为临床妊娠。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

本研究共纳入667对不孕夫妇，最终获得临床妊娠334例，总妊娠率为50.07%(334/667)；流产数66例，总流产率为19.76%(66/334)。不同DFI水平组一般资料如男、女方年龄、精子浓度、精子活率、获卵数、卵裂率、优质胚胎数、移植日子宫内膜厚度及移植胚胎数比较均无统计学差异(P>0.05)，但高DFI组的受精率显著低于低DFI组(P<0.05)(表1、2)。

表1 男方患者一般资料的比较(-±s)

表2 女方患者一般资料的比较(-±s)

注：与低DFI组比较，*P<0.05

二、不同精子DFI水平对妊娠结局的影响

不同精子DFI的两组比较，低DFI组的临床妊娠率显著高于高DFI组(54.21% vs. 42.11%)(P<0.05)，流产率则显著低于高DFI组(16.81%vs. 27.08%)(P<0.05)(表3)。

表3 不同精子DFI水平对妊娠结局的影响(%)

注：与低DFI组比较，*P<0.05

三、低DFI组中不同受精方式(IVF/ICSI)对妊娠结局的影响

低DFI组中IVF组和ICSI组的临床妊娠率分别为52.63%、58.62%，组间比较无显著性差异(P>0.05)；IVF组和ICSI组的流产率分别为15.88%、19.12%，组间比较亦无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 不同受精方式对低DFI组妊娠结局的影响(%)

四、高DFI组中不同受精方式(IVF/ICSI)对妊娠结局的影响

高DFI组中IVF组和ICSI组的临床妊娠率分别为33.33%、48.48%，ICSI组显著高于IVF组(P<0.05)；且ICSI组的流产率显著低于IVF组(40.63% vs. 20.31%)(P<0.05)(表5)。

表5 不同受精方式对高DFI组妊娠结局的影响(%)

注：与IVF组比较，*P<0.05

讨 论

精子DNA损伤是多重因素协同作用的结果，主要包括：精子发生异常、氧化应激损伤、精子异常凋亡。目前大家比较关注的问题是辅助生殖的妊娠结局是否受精子DNA 损伤的影响。有研究报道，在辅助生殖过程中，体外受精失败、胚胎发育异常、胎儿出生缺陷以及后代高发病率等均与不同程度的精子DNA损伤相关[4]。因此重视精子DNA完整性的检测及治疗是十分有意义的。目前评价精子DNA完整性的主要指标是精子DFI，关于其能否预测ART的妊娠结局，一直存在较大争议。

关于精子DFI程度对精液常规分析的影响，各研究结论并不一致。有研究认为精子DNA碎片率与精子密度、精子活率及精子正常形态率呈负相关[5]；但也有研究表明传统的精液参数如精液密度、运动性及正常形态率与DFI无显著相关性[6]。关于不同研究中常规精液参数和DFI之间相关性的争议可能归因于[7]：(1)DNA完整性测试的方法不同，可影响DNA损伤的不同方面，并不总是能提供可比较的结果；(2)常规精液参数分析中应用的方法学和标准的可变性，可能会影响结果的准确性；此外，各种指南如WHO 1999年或2010年手册因研究而异，可能导致确定“正常”的参考限制混淆；(3)精液参数测试中的质量控制方案不同及主观性影响；(4)所研究的人口群体选择标准缺乏统一性。本研究结论与后者[6]一致，可能与纳入的研究对象或处理流程中存在上述因素有关。

另外，有关于精子DNA完整性的流行病学观点认为，精子DFI程度与IVF成功率成负相关。本研究显示低DFI组的受精率显著优于高DFI组(P<0.05)。正常情况下，卵母细胞具有修复轻微精子DNA损伤的能力，但是当精子DNA损伤≥8%时这种修复机制便不再起作用，高水平精子DNA损伤仍可以阻碍卵母细胞激活，从而影响胚胎发育[8]。有学者认为引起患者受孕率显著下降的精子DFI阈值为>30%，Lewis等[9]研究也证实当精子DFI>30%时，自然受孕和宫腔内人工授精(IUI)助孕的成功率几乎为零。且高水平的DFI会引起受精率降低、胚胎质量下降，影响囊胚形成、引发胚胎停育等不良结局[10-11]，本研究与上述结论一致。本研究也显示低DFI组的受精率、临床妊娠率均显著优于高DFI组，且流产率显著低于高DFI组(P均<0.05)，表明精子DNA损伤程度对受精能力及妊娠结局有重要影响。

本研究还发现在低DFI组，常规IVF或ICSI受精后的临床妊娠率、流产率并无显著性差异(P>0.05)，与Chi等[12]的研究结论一致。但关于高DFI组的患者行ICSI还是IVF目前尚无统一定论。Anifandis等[13]研究表明，在精子DFI高水平组行IVF和ICSI助孕时，两种方式的妊娠结局差异并不显著(P>0.05)。但另有研究显示，相比常规的IVF，ICSI助孕更能改善高DFI水平组患者的临床妊娠结局，包括分娩率[14]和临床妊娠率[14-17]。本研究结果显示：高DFI组中ICSI组的临床妊娠率显著高于IVF组(P<0.05)，证实了精子DFI在较高水平时，采用ICSI助孕可获得较高的临床妊娠率。另外，本研究中接受ICSI助孕的患者中，高DFI、低DFI组的临床妊娠率分别为48.48%(64/132)、58.62%(68/116)，二者比较差异并不显著(P>0.05)，表明精子DNA损伤引起的妊娠率下降可通过ICSI得到改善。本研究结果还显示高DFI组中IVF、ICSI的流产率分别为40.63%、20.31%，二者比较有显著性差异(P<0.05)，这可能与ICSI助孕时大多选择形态正常且运动较快的精子有关。

本研究结果显示精子DNA损伤会不同程度影响ART妊娠结局，因此降低精子DFI是十分必要的。精子DNA损伤大多来自于活性氧(ROS)对精子的破坏[18]，目前临床上改善精液质量的药物以抗氧化剂为主，其中维生素E在治疗男性不育中的价值得到广泛认可[19]。一项动物实验表明，在饲料中添加浓度为12 g·kg-1·h-1的维生素E，可以显著提高小鼠精液中相关酶的活性和精子DNA完整性[20]。李维宏等[21]在研究维生素E治疗不明原因男性不育有效性的meta分析中推测出维生素E可能是通过降低精子DNA碎片比例来增加DNA完整性。因此精子DNA损伤水平较高者可先行药物治疗后再进一步助孕治疗，或许可以改善妊娠结局。另外关于精子DNA检测的方法，目前主要有SCSA、彗星实验、流式细胞技术、PCR及基因芯片技术等检测方法，但是关于这些检测技术目前并无标准化、规范化的操作方法及严格的质量控制来保证精子DNA损伤检测的准确性。目前认为SCSA是检测精子DNA损伤的金标准。本研究中采用了SCSA染色后再通过流式细胞仪检测的方法，流式细胞仪能发现精液常规检测中不能发现的信息，不仅具有灵敏度高的优点，还能客观、快速地通过对精子DNA质量的分析来揭示精子发生及成熟过程中的病理变化过程，因此提高了本研究中精子DNA检测水平的准确性。

本研究虽然严格控制了研究对象的纳入标准，排除了患有如子宫内膜异位症、PCOS等疾病的女性，一定程度上增加了研究结论的可靠性，但由于本研究是回顾性分析，可能在样本选择上具有偏倚性，并且研究资料样本量较少，尤其是精子DFI较高者，从而对部分结论(如精子DNA对精液密度及活率的关系)产生了影响。另外关于精子DFI对ART妊娠结局的影响，各个研究由于纳入对象、研究及检测方法不同，结论尚存在较大差异。本研究与前述既往部分研究基本一致，但还需进一步加大样本量，规范精子DFI检测方法及诊断标准，并进行前瞻性研究，以进一步证实精子DFI对妊娠结局预测的可靠性与科学性。

综上所述，精子DNA完整性对辅助生殖的妊娠结局有重要意义，精子DFI水平较高时选择ICSI助孕可能更有利于妊娠结局，临床工作中应重视精子DNA完整性的检测。关于高水平精子DFI患者行ICSI对妊娠结局的影响，后续需扩大样本量进一步探讨，以期更好地指导临床工作；另外，关于如何在行IVF或ICSI助孕前降低精子DNA损伤及其对后代的影响值得进一步关注。