推拿手法对神经病理痛大鼠背根神经节和脊髓背角NMDAR2B表达的影响*

陈水金 江 煜 陈乐春 陈进城 林志刚△

神经病理痛(Neuropathic pain，NP)是由躯体感觉神经系统的损伤或功能紊乱而造成的以痛觉过敏为主要表现的疼痛综合征，临床常见、多发[1～3]。临床观察发现推拿能有效干预神经病理痛，但作用机制尚不明确。近年来，研究发现以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体为代表的一类离子型谷氨酸(Glu)受体，尤其是2B亚单位(NR2B)的NMDA受体与NP关系密切，在NP的发生和发展过程中发挥重要作用[4]。有学者采用坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型(CCI)研究NP大鼠脊髓背角NMDA受体NR2B亚基表达，发现NR2B蛋白表达增加是导致大鼠神经病理痛的原因之一[4～6]。本研究通过观察推拿手法对CCI大鼠背根神经节和脊髓背角NMDAR2B的表达，探讨推拿手法镇痛的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组清洁级雄性SD大鼠，体质量为180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证：SCXK(沪2014-0002)，单笼适应性饲养3 d后按照随机数字表法分成空白组、假手术组(分离坐骨神经但不进行结扎)、CCI模型组、CCI模型+推拿组，每组8只。

1.2 主要仪器与试剂von-Frey纤毛(美国Stolting公司)、无线触觉力测量指套(美国Finger TPS公司)、热痛仪(美国IITC Life Science)、高速冷冻离心机(美国Beckman公司)、超声波细胞破碎仪(美国BRANSON公司)、垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)、电转仪(美国Bio-Rad公司)、Automatic凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、Image La成像及分析软件(美国Bio-Rad公司)、兔抗NR2B多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)、小鼠抗β-actin单抗(美国Jackson公司)、羊抗兔HRP IgG二抗(美国Jackson公司)、BCA蛋白定量试剂盒、ECL反应液(美国Millipore公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 神经病理痛模型的建立参照Bennett G J的方法稍作改进建立大鼠CCI模型[7]。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉后，侧卧位固定，消毒备皮，于大鼠右股骨中段后方约1 cm处平行于股骨切开皮肤、暴露肌肉，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经主干，用4-0铬制羊肠线分3道结扎坐骨神经，每道间隔约1 mm，然后逐层缝合，腹腔注射硫酸阿米卡星(10 mg/kg)预防感染。

1.3.2 神经病理痛模型的验证本实验采用Von-Frey方法测试机械足反射阈值(PWT)及Hargreaves方法测试热缩足反射潜伏期(PWL)，以验证CCI模型是否为疼痛行为表现稳定的动物模型，测定时间、次数及方法等同之前的文献报道[8]。

1.3.3 推拿干预方法推拿组于造模后第4～17天实施每天1次、每次10 min的推拿干预。术者用右手对大鼠右后肢腓肠肌局部进行推拿指揉法操作。为了规范指揉法操作时的刺激量，手法操作过程中右手拇指带上美国Finger TPS公司生产的无线触觉力指套进行推拿手法操作，压力5 N、频率2 Hz。

1.4 检测指标及方法用Western blot检测背根神经节和脊髓背角组织NR2B蛋白的表达：疗程结束后，所有组别大鼠麻醉后断头放血，立即于冰盘上用无菌器械迅速切取右侧L4、L5背根神经节及右侧脊髓背角，分别置于1.5 ml离心管中，称重。加入裂解液(按组织重量与RIRA组织裂解液体积比为1∶80 mg/μl)，超声细胞破碎仪机匀浆，冰上裂解30 min，然后以14000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后冰冷转膜(280 mA∶90 min)，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别在NR2B(1∶500)和β-actin抗体(1∶2000)中孵化过夜，TBST液洗膜，加入HRP标记二抗(1∶2000)室温(37 ℃)孵育1 h，ECL发光法试剂盒显色，使用Bio-Rad Automatic凝胶成像系统成像，Image Lab软件对蛋白条带进行灰色值分析。

1.5 统计学方法应用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计数资料采用χ2检验；计量资料采用t检验或秩和检验。当P≤0.05时，差异有统计学意义；当P≤0.01时，则表示差异有显著统计学意义；而P>0.05则表示差异无统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功CCI造模后第10天，CCI模型组和CCI+推拿组大鼠的PWT值、PWL值达最低水平，并保持在稳定的水平，有明显的机械痛觉过敏及热痛觉过敏现象，为疼痛行为表现稳定的动物模型。

2.2 Western blot法检测背根神经节NMDAR2B表达的改变与空白组、假手术组相比，CCI模型组、CCI+推拿组的背根神经节NMDAR2B的表达量均上调(P<0.01)；CCI模型组、CCI+推拿组的背根神经节NMDAR2B的表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组大鼠右侧L4、L5背根神经节NMDAR2B表达量比较 (例，

2.3 Western blot法检测脊髓背角NMDAR2B表达的改变与空白组、假手术组相比，CCI模型组的脊髓背角NMDAR2B的表达量上调(P<0.01)；与CCI模型组比较，CCI+推拿组的脊髓背角NMDAR2B的表达量被逆转(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠右侧脊髓背角NMDAR2B表达量比较 (例，

3 讨论

NP是常见的疼痛，相当部分颈肩腰腿痛属于NP范畴，如颈、腰椎间盘突出症或外周神经干或神经分支卡压综合征等引起的疼痛[9]。中医将此类疾病归为“经筋病”范畴，推拿对“经筋病”有很好的效果，如《黄帝内经太素·卷第十九》云：“痛生筋脉皮肤之间，为痹不仁，故以按摩醪醴。” 及《医宗金鉴·正骨心法要旨》曰：“因跌扑闪失，以至骨缝开错，气血郁滞，为肿为痛，宜用按摩法”等，但目前其机制尚不明确。

本研究参照Bennett G J的方法稍作改进建立的大鼠CCI模型造模后引起的疼痛与临床神经损伤后神经病理痛最为贴切。本实验结果发现，CCI模型建立后，大鼠有明显的机械痛觉过敏及热痛觉过敏等痛觉过敏现象。有研究显示，CCI模型引起疼痛是由其受损部位传入神经异位放电产生异位敏感度提高所致，外周敏化由此产生；但Julius D用电刺激麻醉的受损部位后仍出现痛觉过敏，由此并不是单纯外周敏化起作用，脊髓及脊髓以上神经元对疼痛刺激的敏感性(即中枢敏化)亦起作用[10～12]。

背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)作为痛觉传入的第一级神经元，在痛觉的外周敏化机制中起着重要的作用[13]。研究表明，外周敏化的持续兴奋性冲动经DRG的Aδ和C纤维传入脊髓背角，引起脊髓背角释放谷氨酸增加，激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，加强脊髓背角突触后反应、增多异位放电，引起中枢敏化[14～16]。

NMDA受体由NR1、NR2(A、B、C、D)、NR3(A、B)亚单位组成的聚合体。不同的亚基因其结构及部位的不同介导不同的生理功能，目前有研究发现NR2B亚基与疼痛密切相关，认为疼痛刺激经外周感觉纤维传入DRG，调控DRG合成NR2B蛋白，再分布于脊髓背角，使脊髓背角NMDA受体激活，引起中枢敏化[13，17]；本研究发现CCI模型DRG和脊髓背角NR2B表达量高于空白组、假手术组，与报道吻合；DRG和脊髓背角的含有NR2B亚基的NMDA受体在NP的产生和维持中起到重要作用。有研究发现神经损伤后大鼠脊髓背角NR2B表达明显增加，本研究CCI模型脊髓背角NR2B表达量高于假手术组，与上述相关报道一致；虞雪融等[5]运用NR2B拮抗剂能降低脊髓NR2B的表达，减轻疼痛；本研究发现推拿手法对DRG中NR2B蛋白表达没有影响，但可抑制脊髓NR2B蛋白表达，由此推测推拿手法通过抑制脊髓NR2B蛋白表达，抑制脊髓背角中枢敏化，从而起到镇痛的效应。

综上所述，背根神经节和脊髓背角NMDA受体亚单位NR2B参与大鼠神经病理痛的形成和维持，推拿手法可通过抑制脊髓NR2B蛋白表达，从而抑制脊髓背角中枢敏化以发挥镇痛的作用。