3种抗生素对黑麦草种子萌发的生态毒性效应

邓世杰，马辰宇，严岩，叶晓枫，王国祥,2,*

1. 南京师范大学环境学院，南京 210023 2. 江苏省地理信息资源开发与利用协同创新中心，江苏省环境演变与生态建设重点实验室，江苏省水土环境生态修复工程实验室，南京 210023

抗生素是一类天然、半合成或合成的化合物，主要用于杀死或抑制人或动物体内的微生物[1]。自1928年问世以来，抗生素的研制技术不断发展，目前发现的抗生素已经达到数千种[2]。除在医药业作为药物治疗人类和动物疾病外，抗生素在农业上亦有广泛应用，它可以作为肥料或畜禽饲料，提高动物、农作物的质量和产量[3]。抗生素及其代谢产物随畜禽排泄物进入环境介质后，不易降解，能长时残留，造成环境污染，危害人体健康，影响生态平衡[4]。我国是抗生素生产和使用大国，每年生产的抗生素超过200 000 t，国内消耗的约占75%[5]。其中四环素类、喹诺酮类和磺胺类抗生素的使用量较大，但利用率不高，大部分以原药的形式通过不同的途径进入环境，对环境造成了严重的污染。并且，抗生素会在生物体内富集，通过生物放大，对人类健康和生态系统造成潜在的危害[6]。

抗生素对植物的生态毒性效应研究多集中于对植株的影响[7]。黑麦草(Loliumperenne)是一种一年生或多年生植物[8]，具有适应性强、生物量大和根系发达等特点[9-11]，被广泛用于草坪草种植，兼有降解污染物的功效[12]。黑麦草对镉和铅等土壤重金属有较强的富集作用[13]。在人工湿地研究上，它对污水中的总氮和总磷有很好的去除效果[14]。目前，抗生素对黑麦草的生态毒性效应研究主要是针对黑麦草植株，但抗生素对黑麦草种子的生态毒性效应尚未明确。而种子萌发是黑麦草生命周期的起始阶段，是黑麦草植株生长发育的先决条件，对黑麦草植株生长发育起着至关重要的作用[15]。因此，有必要研究抗生素对黑麦草种子萌发的生态毒性效应。

本试验以黑麦草种子为研究对象，研究四环素、环丙沙星和磺胺嘧啶3种抗生素在不同浓度处理水平下对黑麦草种子发芽、根长和芽长的影响，并探讨了抗生素胁迫对黑麦草种子根、芽伸长抑制率的影响，以期为评价抗生素污染的生态影响提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验选择发育正常的意大利黑麦草种子，供试所用黑麦草种子由江苏省农业科学院提供。实验使用的试剂为3类抗生素，分别为四环素(纯度98%)、环丙沙星(纯度98%)、磺胺嘧啶(纯度98%)，均购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 实验方法

种子经质量分数为50%的H2SO4处理除去颖壳，用体积分数为10%的H2O2溶液消毒10 min，之后用去离子水冲洗3遍，滤干。在直径9 cm的培养皿中放入2张滤纸，用镊子将20粒种子整齐地排列在培养皿中，加入10 mL抗生素溶液，浓度梯度设定为：0、0.1、0.5、1、5和10 mg·L-1，对照中加入等量的去离子水，每个处理3个重复。培养时，将培养皿置于25 ℃光照培养箱内，光照时间16 h·d-1，光照强度3 000 lx。

1.3 分析方法

1.3.1 发芽势、发芽率、发芽指数及根长、芽长抑制率的测定

实验期间每天测定种子的发芽率，直到种子的发芽率趋于稳定时，结束培养并测定根长和芽长，以此计算根长和芽长的抑制率。其中在第3天测定的种子发芽率为黑麦草种子的发芽势。

发芽势(%)=第3天时供试种子的发芽数/供试种子总数×100%[16]

发芽率(%)=供试种子的发芽数/供试种子总数×100%[16]

发芽指数(GI)=Σ(时间t的发芽数/相应的发芽天数)[16]

根长或芽长抑制率(%)=(对照组-处理组)/对照组×100%[16]

1.3.2 半数抑制浓度(IC50)的计算

建立种子的根长、芽长抑制率与对应的抗生素浓度的线性回归方程，当根长、芽长抑制率为50%时，对应的抗生素浓度即为该种抗生素对根长、芽长的IC50值。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013对数据进行处理，采用IBM SPSS Statistics 20统计分析软件对数据进行差异显著性检验。本文中数据为3组平行试验的平均值，或平均值±标准差。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 抗生素对黑麦草种子发芽率的影响

抗生素对黑麦草种子发芽率的影响如图1所示。黑麦草种子在不同抗生素浓度处理下均在第3天发芽，表明抗生素不会引起黑麦草种子萌发期的变化，但对种子萌发的过程有一定影响。在黑麦草种子发芽初期，四环素对黑麦草种子发芽有促进作用，而环丙沙星、磺胺嘧啶有一定抑制作用。萌发过程第7天时，抗生素浓度超过5 mg·L-1时，四环素对种子发芽表现为促进作用，环丙沙星和磺胺嘧啶对种子发芽表现为抑制作用。磺胺嘧啶处理下，对照组的种子发芽率均高于其他处理水平，且与浓度10 mg·L-1处理组差异显著(P<0.05)。第10天后，3种抗生素处理下黑麦草种子的发芽率均趋于稳定，且1 mg·L-1处理下种子的发芽率最高，该浓度实验组的发芽率与各自对照组相比，差异不显著(P>0.05)。四环素对种子发芽率的最大无作用浓度(NOEC)为5 mg·L-1，而环丙沙星和磺胺嘧啶对种子发芽率的NOEC为1 mg·L-1。有研究表明，一定浓度范围的抗生素胁迫会提高植物种子活力，这可能是植物种子抵抗逆境的应激反应[17]。黑麦草种子虽经受抗生素对它的影响，但它可通过自身代谢反应阻止、降低或者修复由逆境造成的伤害，使其仍保持正常的生理活动，从而发芽率不会受到较显著的负面影响，有时还可能得到促进[18]。而浓度过高时，植物种子的抗氧化酶系统受到破坏，有关酶活力降低[19]，从而抑制种子萌发。不同种类抗生素处理下，黑麦草种子萌发结果不同，主要因为3种抗生素理化性质有差异，对黑麦草种子的作用机制不同[20]。张乙涵等[21]研究表明，种子的种皮可阻碍抗生素胁迫对种子发芽带来的负面影响，而种皮对不同抗生素的阻碍作用不同。并且种皮的阻碍作用是有限的，不能完全阻碍抗生素对种子的毒性效应[20]。本研究中，环丙沙星和磺胺嘧啶浓度达到10 mg·L-1时，种子发芽率受到显著抑制(P<0.05)，说明此时抗生素已经对种子发芽产生了毒性效应。

2.2 抗生素对黑麦草种子发芽势和发芽指数的影响

从表1可知，四环素处理下的黑麦草种子的发芽势均高于对照组；而环丙沙星和磺胺嘧啶处理下，黑麦草种子发芽势均低于对照组。随着四环素浓度的增加，发芽势呈现出先增加后降低的趋势。浓度为1 mg·L-1时，种子的发芽势最高，为65%，比对照组高15% (P<0.05)。在环丙沙星处理下，黑麦草种子发芽势与浓度呈负相关，且各浓度的实验组发芽势均显著低于对照组(P<0.05)。在磺胺嘧啶处理下，黑麦草种子发芽势与其浓度呈负相关，对照组的发芽势与0.1 mg·L-1组差异不显著(P>0.05)，与其他各组差异显著(P<0.05)。各四环素处理组的发芽指数均高于对照组，环丙沙星和磺胺嘧啶处理下发芽指数均低于对照组。但磺胺嘧啶处理下，种子的发芽指数总体上高于环丙沙星处理下的发芽指数。四环素对种子发芽势的影响表现为促进作用，环丙沙星和磺胺嘧啶则表现为抑制作用。这可能是由于黑麦草对3种抗生素的吸收和降解能力存在差异。裴孟等[22]研究表明，黑麦草对四环素类抗生素的降解能力强于对磺胺类抗生素的降解能力，这可能与磺胺嘧啶的化学性质较四环素稳定有关。同时，抗生素对黑麦草根系区的微生物群落结构形成有一定影响，这会减弱黑麦草与微生物之间的养分循环，抑制种子发芽[23]。陈伟立等[24]的研究表明，植物的根系构型亦可影响植物的各项生态过程。本研究中，抗生素可通过对黑麦草根际处微生物的影响，间接调控黑麦草的根系构型，从而对其吸收水分、利用养分等生理与生态过程产生影响。

表1 3种抗生素处理下黑麦草种子的发芽势和发芽指数Table 1 Germination potential and germination index of the seeds of Lolium perenne under three antibiotics stress

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note: compared with the control, *P<0.05.

图1 3种抗生素对黑麦草种子发芽率的影响Fig. 1 Effects of three antibiotics on germination rate of Lolium perenne seeds

图2 3种抗生素对黑麦草种子根长和芽长的影响注：图中不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。Fig. 2 Effects of three antibiotics on root and bud length of Lolium perenne seeds Note: different letters in the graph represent significant differences (P<0.05), and the same letter represents no significant difference (P>0.05).

2.3 抗生素对黑麦草种子根长和芽长的影响

如图2(a)所示，3种抗生素对黑麦草种子根长均有抑制作用。同种抗生素处理下，种子根长随着浓度增加，均表现为先增加后减小。各浓度的四环素、环丙沙星和磺胺嘧啶处理下，种子根长均显著低于对照组(P<0.05)。如图2(b)所示，3种抗生素对种子芽长均有抑制作用。四环素作用下，随着其浓度升高，芽长逐渐减小，各组种子的芽长均显著低于对照组(P<0.05)。环丙沙星作用下，种子芽长随着浓度增加，表现为先增加后减小，各组种子的芽长均显著低于对照组(P<0.05)。磺胺嘧啶作用下，种子芽长的变化趋势与环丙沙星的类似。由于3种抗生素浓度在0.1 mg·L-1时，种子的根长和芽长即受到抑制，因此，3种抗生素对种子根长、芽长的NOEC均在0～0.1 mg·L-1之间。

相关分析表明，四环素、环丙沙星和磺胺嘧啶对根长的IC50值分别为9.846、9.415和3.989 mg·L-1，R2值分别为0.869、0.806和0.969；而它们对芽长的IC50分别为27.506、24.686和21.767 mg·L-1，R2值分别为0.513、0.931、0.784。因此，3种抗生素对种子根长抑制率的相关程度高于芽长，对黑麦草种子根(芽)长的抑制作用强弱顺序为：磺胺嘧啶>环丙沙星>四环素。

与芽长相比，根长受外界环境的影响更显著。由于黑麦草幼苗根部直接与抗生素溶液接触，对其中污染物的响应较为迅速，因此，根长对外界污染物较敏感[25]。鲍艳宇等[26]的研究表明，芽对外源污染物的敏感程度不如根。只有当抗生素浓度在黑麦草种子体内的积累超出其耐受范围时，黑麦草种子芽长才会受到显著抑制。本研究中，当抗生素浓度超过0.5 mg·L-1时，3种抗生素中磺胺嘧啶对根长的抑制作用最显著；四环素、环丙沙星和磺胺嘧啶对种子根长的IC50也表明，磺胺嘧啶对种子根长的抑制作用最显著。这与林琳等[27]、金彩霞等[28]的研究结果类似。这可能是由于磺胺嘧啶与四环素或环丙沙星相比，降解更为缓慢[29]，作用更持久，因而对黑麦草种子的生长影响更显著。

综上，本研究表明，3种抗生素对黑麦草种子的发芽期无影响，但对萌发过程有一定影响：3种抗生素在1 mg·L-1处理水平下均能促进种子发芽；四环素对种子发芽率的NOEC为5 mg·L-1，而环丙沙星和磺胺嘧啶对种子发芽率的NOEC为1 mg·L-1。3种抗生素浓度超过其对应的NOEC时，对黑麦草种子发芽即产生抑制作用。一定程度上，四环素对种子发芽势有促进作用，而环丙沙星和磺胺嘧啶对种子发芽势有抑制作用。四环素处理下发芽指数均高于对照组，环丙沙星或磺胺嘧啶处理下发芽指数均显著低于对照组。在本试验中，根长和芽长在3种抗生素作用下均受到抑制，NOEC均在0～0.1 mg·L-1之间。对3种抗生素的生态毒性敏感顺序为：根长>芽长。黑麦草种子萌发受3种抗生素影响程度依次为磺胺嘧啶>环丙沙星>四环素。