布美他尼与呋塞米K+转运蛋白抑制剂对小鼠听觉功能的影响

钱迪 郑伟昌 敬光怀 陈翠霞 黄俊煊 汤国栋

（广东省深圳市龙华区人民医院耳鼻喉科 深圳518109）

钠钾氯协同转运蛋白1（NKCC1）是中枢神经系统内分布于微血管内皮细胞、神经元细胞膜及星形胶质细胞上的离子转运蛋白，不仅对维持神经元细胞及星形胶质细胞内离子的正常浓度、细胞容积及维持血脑屏障通透性具有重要的意义，还是参与耳蜗K+循环生理机制，对听觉生理功能进行维护的重要功能通道。有相关研究报道证实，NKCC1 蛋白的低表达在听觉功能损伤中发挥了重要的作用[1]。布美他尼、呋塞米是目前临床上应用较为广泛的两类抑制NKCC1 蛋白的K+转运蛋白抑制剂。本研究以30 只健康小鼠为研究对象，以对比布美他尼、呋塞米对NKCC1 蛋白的抑制作用，探讨布美他尼/呋塞米两类K+转运蛋白抑制剂对小鼠听觉功能的影响。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 选取由我市动物中心提供的30 只健康小鼠为研究对象，小鼠经近交自行繁殖培育，均系12 周龄，可保持长时间稳定的听力，体质量12～18 g，平均（15.41±4.33）g。采用随机数字表法将30 只小鼠分为健康对照组10 例，布美他尼处理组10 例，呋塞米处理组10 例。

1.2 研究方法 （1）听觉脑干反应（ABR）检测。布美他尼处理组10 只小鼠和呋塞米处理组10 只小鼠，予以三溴乙醇腹腔注射麻醉，用量0.53 mg/g。采用银针电极，于头顶正中皮下插入正极，于左耳皮下插入参考电极，于右耳皮下插入地极电极。ABR 检测仪器采用美国产ABR 仪，刺激参数设置由电脑产生设定的短声、短纯音的8、16、32 kHz 为刺激声。实验中以能分辨出ABR I 波的最低刺激强度作为ABR 阀值，ABR 检测3 次，取平均值[2]。（2）K+转运蛋白抑制剂处理。布美他尼处理组10 只小鼠于药物处理前行ABR 检测，予以腹腔内注射麻醉后，给予NKCC1 抑制剂布美他尼注射，注射30 min 后再予以ABR 检测；停药3 d，后再次行ABR 检测。呋塞米处理组10 例小鼠于药物处理前行ABR 检测，予以腹腔内注射麻醉后给予NKCC1 抑制剂呋塞米注射，注射30 min 后再予以ABR 检测；停药3 d，后再次行ABR 检测。

1.3 观察指标

1.3.1 健康对照组、布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠ABR 阀值比较 根据检测结果，对比分析健康对照组、布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠ABR 阀值。

1.3.2 布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠给药前后及恢复后ABR 阀值比较 根据检测结果，对比分析布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠给药前后及恢复后ABR 阀值。

1.4 统计学方法 数据处理采用SPSS20.0 统计学软件。计量资料用表示，采用t 检验。多组间数据的简单比较用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠ABR 阀值比较 给药前三组平均ABR 阀值比较，差异无统计学意义（t=2.103，P=0.925）；给药后，布美他尼处理组、呋塞米处理组平均ABR 阀值均高于健康对照组（t=7.142、8.261，P=0.041、0.039），且布美他尼处理组平均ABR 阀值高于呋塞米处理组（t=7.563，P=0.040）。见表1。

表1 三组小鼠ABR 阀值比较（dB SPL

表1 三组小鼠ABR 阀值比较（dB SPL

组别 n 给药前 给药后健康对照组1022.34±4.25-布美他尼处理组1023.45±5.2165.20±10.41呋塞米处理组1023.14±5.3250.35±8.56

2.2 布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠给药前后及恢复后ABR 阀值比较 停止给药恢复后，布美他尼处理组、呋塞米处理组平均ABR 阀值均低于给药后（t=8.284、8.556，P=0.037、0.036），与给药前接近。见表2。

表2 布美他尼、呋塞米处理组给药前后及恢复后ABR 阀值比较（dB SPL

表2 布美他尼、呋塞米处理组给药前后及恢复后ABR 阀值比较（dB SPL

组别 n 给药前 给药后 停止给药恢复后布美他尼处理组1023.45±5.2165.20±10.4127.45±6.26呋塞米处理组1023.14±5.3250.35±8.5625.15±5.54

3 讨论

NKCC1 是Na+-K+-Cl-内向共转运体（Na、K 浓度梯度共同驱动），与K+-Cl-外向共转运体（钾浓度梯度驱动）同属于氯偶联的共转运体家族，市面上针对NKCC 靶点的药物开发主要集中在心脑血管疾病治疗领域，包括高血压、水肿以及心力衰竭等[3]。近年来，随着临床医学及动物实验对耳聋疾病病理机制研究的不断深入，诸多文献研究报道强调NKCC1 蛋白的低表达在听觉功能损伤中发挥了重要的作用[4]。临床上，关于NKCC1 在听觉功能中的作用尚无确切结论，但国内外一致持有如下观点：NKCC1 可通过对内向性Na+浓度梯度的利用以1 Na+:1K+:2Cl-的比例将离子转运至边缘细胞，而经边缘细胞顶膜上的KCNQ1 通道将K+分泌至淋巴，进而形成EP；同时分泌至耳蜗内淋巴中的K+经基底膜毛细胞与螺旋韧带间的通道进行转运，再次进入边缘细胞，以此循环，构成耳蜗K+循环机制，进而对听觉功能进行维持[5]。布美他尼/呋塞米两类K+转运蛋白抑制剂对NKCC1 蛋白的表达具有显著的抑制作用，这两类药物所造成的听力损伤是双侧对称性，这主要是因为该两类药物与内耳毛细胞膜接触，增加了内耳毛细胞的通透性，而袢利尿剂以较高的浓度进入到细胞内，引起了毛细胞的损伤。

褚汉启等的研究中应用NKCC1 抑制剂呋塞米对CBA/CaJ 和Castel 两种鼠系进行了离子转运蛋白抑制-听觉实验，并对小鼠ABR 阈值进行检测，结果显示小鼠经呋塞米注射30 min 后，ABR 阈值显著高于注射前（P＜0.01），且显著高于正常对照组（P＜0.01），提示呋塞米对NKCC1 具有显著的抑制作用，会对小鼠听觉功能造成影响，这与本次研究结果一致[6]。王桥生等按随机数字法将SD 大鼠分成假手术组、脑缺血组和布美他尼组，结果显示大鼠予布美他尼干预后，NKCC1 表达均显著下降（P＜0.05），证实布美他尼可通过下调NKCC1 表达水平改善缺血性脑水肿和神经功能[7]。而目前尚无关于布美他尼/呋塞米两类K+转运蛋白抑制剂对小鼠听觉功能及NKCC1 抑制作用的对比研究文献报道。本研究采用对照研究的方法，分别对健康对照组、布美他尼处理组、呋塞米处理组小鼠的ABR 进行检测，结果给药后，布美他尼处理组、呋塞米处理组平均ABR 阀值均高于健康对照组（P＜0.05），即经布美他尼、呋塞米两类K+转运蛋白抑制剂处理后，小鼠听觉功能明显损伤。经药物处理后，布美他尼处理组平均ABR 阀值高于呋塞米处理组（P＜0.05），停止给药恢复后，布美他尼处理组、呋塞米处理组平均ABR 阀值均低于给药后（P＜0.05），与给药前接近，提示布美他尼对NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，对小鼠听觉功能的损伤影响高于呋塞米。

综上所述，布美他尼K+转运蛋白抑制剂对NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，对小鼠听觉功能的损伤影响高于呋塞米。