猪前交叉韧带重建联合髌骨脱位多间室骨关节炎模型的步态分析*

赵瑞鹏 李志强 顾晓东 韩鹏飞 李鹏翠 李春江 王小虎 段王平 卫小春**

（1.山西医科大学第二医院骨科，太原 030001；2.吕梁市人民医院骨科，山西吕梁 033000）

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨慢性退变和继发关节软骨骨化为主要病理变化，关节间隙渐进性狭窄、骨赘形成及关节胀痛、活动功能障碍为主要临床表现的疾病[1,2]。随着社会快速发展，车祸、建筑摔伤、体育竞技等高能量外伤事故不断增多，临床上半月板损伤、交叉韧带撕裂、髌骨骨折以及随之而来的OA患者也逐渐增多。调查表明，至2020年OA可能成为全球第四大致残疾病，给个人及国家带来沉重的负担[3,4]。

膝关节是由股骨远端、胫骨近端、髌骨内侧关节面及周围韧带、肌肉包裹构成的作用关键、功能复杂的承重关节，同时也是OA重要的病变部位[5,6]。传统OA动物模型制备手术主要包括前交叉韧带切断术（anterior cruciate ligament transection,ACLT）、前交叉韧带重建术（anterior cruciate ligament reconstruction,ACLR）、半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus,DMM）、髌骨脱位术（patella dislocation）等，制备的胫骨内侧平台、股骨内侧髁、髌骨关节等单一间室OA模型都不能很好地模拟临床发病率较高的多间室OA病变特征[7-9]。由此，本课题组采用巴马小型猪建立ACLR联合髌骨脱位术制备多间室OA模型。猪的生理特征、体液生化指标、骨质结构更加接近人类。与鼠、兔、羊相比，猪软骨组织中的胶原纤维排列更接近人软骨。同时，由于圈养猪体格较大、摄食较多，不方便管理和手术操作。本课题组采用心血管、消化、泌尿、皮肤、口腔等学科常用的巴马小型猪制备多间室OA模型[10,11]。此外，步态分析研究已广泛应用于医学领域，尤其在神经系统疾病[12]。

本实验利用巴马小型猪，建立ACLR联合髌骨脱位术制备多间室OA病变模型，通过步态分析仪收集步态数据，旨在评估髌骨脱位状态下多间室OA的步态特征，揭示多间室0A病变的影响因素，帮助OA 患者早期临床诊断、治疗及康复。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18月龄健康雌性巴马小型猪6只，体重（41.6±3.5）kg，购于北京市实创世纪小型猪养殖基地[许可证号SCXX(jing)2013-0008]。饲养于中国辐射防护研究院[许可证号SYXK(Jin)2016-0002]。

1.2 实验试剂与仪器

舒泰50（virbac S.A），前交叉韧带重建导向器（Arthrex，Inc.），软骨环钻（MOC Medizinische Gerate Gmbh，ø8 mm），超声脱钙仪（VCare）步态分析仪器：Tekscan walkway.v.7.6x（Tekscan，Inc.307 West First Street，South Boston，MA 02127）。

1.3 动物模型的制备

实验动物术前12 h禁食，称体重，舒泰50肌内注射麻妥（1 ml/15 kg），左侧卧位，右后肢（right hind,RH）膝关节剃毛备皮，碘伏消毒，铺巾。

手术造模过程如图1所示。取右后肢髌骨外侧切口，以髌骨外缘2 cm为中心纵向切“S”形切口，长约8 cm，逐层切开膝关节外侧支持带和部分股四头肌，切开关节囊，向内侧推开髌骨使其内脱位，显露膝关节前交叉韧带。前交叉韧带重建导向器钩住韧带股骨止点端与纵轴线成45°，插入克氏针套筒固定。空心钻（内径0.8 cm）以克氏针套筒为圆心从股骨外侧髁外面钻向前交叉韧带附着处，钻透前（深约1.8 cm）停止空心钻，防止韧带从股骨止点处断裂。克氏针（直径1 mm）沿着孔道外围不断穿透，保证空心钻钻取得到的骨柱带着前交叉韧带完整分离。穿透后，向关节腔内推出骨柱检查前交叉韧带完整附着于骨柱，附着前交叉韧带的骨柱沿空心钻骨道回退，恢复原位，2根克氏针（直径1.5 mm）从股骨外侧髁外面（空心钻钻口处）斜穿交叉固定骨柱彻底冲洗伤口，髌骨内脱位状态下部分缝合外侧关节囊，手法屈伸膝关节观察髌骨运动轨迹并保证髌骨不能复位于股骨滑车沟内，关节囊外层逐层缝合。术后行X线检查，确保模型制备成功（图2）。左后肢（left hind,LH）不做任何处理作为正常对照。

1.4 步态数据的采集

为了排除动物个体行走、学习技能之间的差异。所有实验动物术前10 d开始步态训练，全程匀速、正常步态通过步态分析仪记录1 次（图3），每只动物每天成功记录5次，连续训练10 d。术前（图4），术后7、15、30、45、60、75、90 d 采集实验动物步态数据，具体包括：体重（body weigth,BW）、后肢负重（%BW）、后肢触地面积（cm2）、后肢触地冲量（%BW·s）、后肢足底局部最大压力（%BW）、后肢摆动相时间（s）、后肢支撑相时间（s）。为减小误差，排除个体差异，负重指标采用自身BW%表示。每个时间点记录5次。

1.5 病理观察

术后3 个月安乐处死所有动物，髋关节离断，获取LH 和RH。打开膝关节囊，应用环钻在股骨滑车处钻取骨柱。骨柱在4%多聚甲醛固定48 h 后，超声脱钙仪中浸泡脱钙10周。骨柱依次脱水、浸蜡、切片（6 μm），番红“O”染色，光镜下观察。

1.6 统计学方法

图1 手术造模过程

图2 造模后RH正位（A）、侧位（B）X线检查显示髌骨处于内脱位状态

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。实验动物步态数据经统计学分析均符合偏态分布，采用M（QR）表示。采用Mann-WhitneyU检验法比较实验动物RH与LH步态数据差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

所有实验动物无麻醉意外，术后6 h内实验动物清醒，无感染与死亡，切口愈合良好。

2.2 后肢负重结果

图3 巴马小型猪迈步模式图

自然状态下实验动物RH 与LH 负重基本相等，差异无统计学意义。术后RH 负重明显降低，LH 负重有所增加。术后60 d，RH负重恢复到最高水平，但与LH比较差异仍有统计学意义。术后各时间点RH负重均低于LH，且差异均有统计学意义（表1）。

2.3 后肢触地面积结果

自然状态下实验动物RH与LH触地面积基本相等，差异无统计学意义。术后RH 触地面积明显减小，LH触地面积有所增加。术后45、60 d，RH触地面积恢复到最高水平，但与LH比较差异仍有统计学意义。术后各时间点RH 触地面积均小于LH，且差异均有统计学意义（表2）。

图4 术前应用Tekscan walkway步态分析仪采集步态原始图

2.4 后肢触地冲量结果

自然状态下实验动物RH与LH触地冲量大小基本相等，差异无统计学意义。术后RH触地冲量明显减小，LH触地冲量有所增加。术后60 d，RH触地冲量恢复到最高水平，但与LH比较差异仍有统计学意义。术后各时间点RH触地冲量均小于LH，且差异均有统计学意义（表3）。

2.5 后肢足底局部最大压力结果

自然状态下实验动物RH与LH足底局部最大压力基本相等，差异无统计学意义。术后7、15、30、45 d RH足底局部最大压力明显降低，LH足底局部最大压力有所升高，两者比较差异均有统计学意义。术后60 d，RH足底局部最大压力恢复到最高水平，与LH比较差异无统计学意义。但在术后75、90 d，RH足底局部最大压力均低于LH，且差异均有统计学意义（表4）。

2.6 后肢摆动相时间结果

自然状态下实验动物RH与LH摆动相时间基本相等，差异无统计学意义。术后7、15、30 d RH 摆动相时间明显延长，LH摆动相时间基本保持不变，两者比较差异均有统计学意义。术后45、60 d RH摆动相时间逐渐恢复到自然状态水平，与LH比较差异无统计学意义。但在术后75、90 d，RH摆动相时间均长于LH，且差异均有统计学意义（表5）。

2.7 后肢支撑相时间结果

自然状态下实验动物RH与LH支撑相时间基本相等，差异无统计学意义。术后7、15、30、45 d RH支撑相时间明显缩短，LH支撑相时间有所增加，两者比较差异均有统计学意义。术后60、75 d RH支撑相时间逐渐恢复到自然状态水平，与LH比较差异无统计学意义。但在术后90d，RH支撑相时间短于LH，且差别有统计学意义（表6）。

2.8 病理观察结果

番红“O”染色显示，LH软骨表面完整，蛋白多糖含量丰富，软骨细胞数量、形态正常，纤维化不明显。相反，RH软骨表面破坏明显，裂痕较深，蛋白多糖含量明显下降，软骨细胞数量显著增多、形态各异，纤维化明显（图5）。

3 讨论

OA是一种病因复杂、病理变化缓慢，多种生物力学和生物化学因素综合作用导致的一种关节软骨慢性退变性疾病,具体发病机制仍不明确[13]。目前研究较为明确的是炎症因素在OA发病过程中较为关键，退变关节局部出现大量炎症因子、基质降解酶类，促使大量关节软骨细胞异常凋亡，导致关节软骨进一步退变[14]。在胫股OA动物模型制备方法中，ACLT较为常见。但ACLT 模型在模拟炎症作用的同时破坏前交叉韧带，破坏膝关节的稳定性，改变膝关节的正常力学性能，不利于胫股OA独立病因的分析。所以本实验采用ACLR模型，单一因素模拟胫股OA[15]。髌股关节为膝关节的重要组成部分，在临床OA患者中其病变较常见，也较严重，本实验采用髌骨脱位术制备髌股关节炎模型。本实验采用ACLR 联合髌骨脱位术制备多间室OA模型，其病变特征更符合临床。

表1 术前与术后各时间点实验动物RH与LH负重比较[n=6，M（QR），%BW]

表2 术前与术后各时间点实验动物RH与LH触地面积比较[n=6，M（QR），cm2]

表3 术前与术后各时间点实验动物RH与LH触地冲量比较[n=6，M（QR），%BW·s]

表4 术前与术后各时间点实验动物RH与LH足底局部最大压力比较[n=6，M（QR），%BW]

表5 术前与术后各时间点实验动物RH与LH摆动相时间比较[n=6，M（QR），s]

表6 术前与术后各时间点实验动物RH与LH支撑相时间比较[n=6，M（QR），s]

图5 LH和RH病理观察结果番红“O”染色图

步态是指人或动物通过肢体运动并向前移动的一种周期性的形式和状态特征。机体站立或步行时足底与支撑面之间的相互作用力能反映下肢及全身的生理、解剖及功能等方面的变化。步态分析即通过生物力学和运动学手段，揭示步态异常的关键环节和影响因素，帮助早期临床诊断，疗效评估，指导康复[16,17]。目前Tekscan walkway系统应用较为广泛[18]。

本实验采用巴马小型猪，四肢承重，十字交叉迈步，自然健康状态下，LH与RH负重基本相当。由于手术创伤、疼痛，导致术后RH疼痛不能负重，尤其术后7 d。随着术后时间延长，RH负重不断恢复，在术后60 d达到最高水平，但仍未恢复到正常，此时手术疼痛已经不是主要原因，可能主要由于髌骨脱位，RH膝关节的正常屈伸、行走功能受到影响，导致RH负重仍恢复不到正常水平。而术后75、90 d RH的负重水平又明显下降，其原因可能是炎症因素已经触发膝关节软骨病变，且较为严重。已有小动物实验证实，膝关节创伤后1周甚至第二天，膝关节周围炎症因子水平开始显著上升，已经触发软骨降解、退变[19,20]。同时实验证实，RH膝关节受到创伤负重下降时，LH反而负重增加，起到代偿作用，这一现象与临床一致。一侧肢体发生OA病变时，身体中心就不断转向对侧肢体。触地面积为机体行走时足底与支撑面的接触面积，其变化趋势类似于后肢负重变化趋势，原因较为一致。术后7 d RH触地面积最小，可能由于疼痛导致RH脚尖点地前行，术后60 d恢复到最大接触面积。术后75、90 d可能是炎症因素已经触发膝关节软骨病变，触地面积又出现下降趋势。触地冲量为足底踩踏地面过程中作用力的时间累积，是支持力与时间的乘积，影响因素为负重大小、支撑时间。其变化趋势是负重趋势和支撑相趋势综合作用的结果，其差异更加显著。由于足底骨性构造、足弓的存在，足底与支撑面接触时受力并不均匀，人类足底外侧受力明显高于内侧[21]，四足动物足底受力类似人类，并不均匀。本研究得出术后早期RH足底最大压力变化趋势与负重变化趋势较为一致，术后60 d恢复到较高水平，与LH比较差异无统计学意义。术后75、90 d可能是炎症因素已经触发膝关节软骨病变，RH足底局部最大压力又出现下降趋势，低于LH且差异有统计学意义。尽管实验动物为四肢负重，十字交叉迈步，但其特征类似于人类，整个步态周期由支撑相和摆动相组成。由于手术的创伤、疼痛，导致术后RH支撑相显著缩短，摆动相延长，尤其在术后7、15 d。其表现类似于临床OA患者，病变肢体迈步缓慢，撑地时间缩短。摆动相期间肢体处于非负重状态，其恢复较快，术后45 d恢复到自然状态水平。术后75、90 d又出现恶化趋势。LH在摆动相期间处于非负重状态，不起代偿作用，故LH的摆动相在术前、术后各时间点变化不明显。支撑相期间，肢体处于负重状态，其恢复相对较慢，术后60 d RH恢复到自然状态水平。术后90 d又出现恶化趋势。

番红“O”染色结果显示，RH有明显的软骨退变，其原因可能是炎症因素已经触发膝关节所有间室软骨病变，且较为严重；此外，髌骨处于脱位状态，膝关节失去正常的力学性能。生物力学和生物化学因素综合作用导致RH病变严重。LH单纯起负重代偿作用，其影响较小，软骨退变不明显。

本实验不足之处：OA 是一种慢性软骨退变性疾病，其病程较长。而本实验术后90 d 安乐处死所有动物，不利于了解OA的全部病理过程。

本实验采用ACLR联合髌骨脱位术制备大动物多间室OA模型，较为客观、全面，同时采集、分析步态实验相关指标和数据。初步确定多间室OA模型制备成功；初步明确多间室OA步态行为学变化，为今后动物模型制备、疾病机制基础研究、临床疾病治疗及康复提供一定帮助。