超高效液相色谱-串联质谱法快速同时测定生姜中10种营养成分

张文焕, 刘平香, 邱 静, 贾 琪, 钱永忠

(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 农业农村部农产品质量安全重点实验室, 北京 100081)

生姜是人们日常生活中的重要调味品之一,在我国及世界各地均有广泛种植,其品种多样,具有特殊的营养保健功效,是“药食同源”的典型代表[1]。生姜中的姜辣素类化合物是其特殊辛辣味的主要来源,它们是一类结构、性质类似的物质,其中含量最高的是姜酚类物质,包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等,还含有少量6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等姜烯酚类物质。从结构上看,它们都有3-甲氧基-4-羟基苯基官能团,姜酚类化合物中还有性质活泼的β-羟基酮结构,这使得生姜具有较强的生物活性[2-4]。研究表明,姜烯酚比姜酚更辛辣,且生物活性更高[5]。生姜中的姜黄素类化合物是其重要的呈色物质,如姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素,它们是自然界中稀有的二酮类天然色素,广泛存在于姜科类植物中[6]。研究表明,包括四氢姜黄素在内的姜黄素类化合物同样具有显著的生物活性,有报道指出四氢姜黄素的生物活性优于姜黄素[7]。此外,生姜中还存在一类挥发性精油物质,它们在鲜姜中含量丰富、种类繁多,一同决定了生姜的气味[8],而香气成分容易挥发,结合生姜的储藏特性和食用特性,生姜的特征营养成分当以姜辣素类和姜黄素类物质为主。大量研究表明,由于生物活性物质的存在,生姜不仅有抗菌、镇痛、止呕、止晕、抗炎、抗癌、抗氧化、降血糖血脂等重要生理作用,还可用于研制治疗心脑血管疾病、风湿性关节炎、胃溃疡等疾病的药物和保健食品[9-13]。

生姜品质主要取决于其含特征营养成分的量,在多国药典中已将6-姜酚的含量作为评价生姜质量的关键指标之一[14]。近年来,生姜中化学成分的测定方法已有较多报道,针对营养成分的检测大多是针对某一物质或某一类物质开展的,如Park等[15]采用高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)方法对生姜中姜辣素类化合物进行了定性筛查和定量测定,并在60 min内鉴定19种姜辣素类化合物,其中6-姜酚含量最高,10-姜酚、8-姜酚次之;Jadhav等[16]和Jayaprakasha等[17]分别建立了HPLC方法对3种姜黄素类化合物同时测定。然而,同时检测两类营养成分的方法未见报道。鉴于生姜中姜辣素类和姜黄素类化合物具有相似的结构特征和功能活性,有必要建立一种同步、快速测定二者的分析方法。

本文采用超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)对生姜中含量较高、活性较强的6种姜辣素类化合物和4种姜黄素类化合物进行了测定,以期在实际样品的检测中得以应用,并为进一步研究生姜中营养成分的变化规律、品质鉴别及资源开发利用提供必要的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(包括Agilent 1290 InfinityⅡ高效液相色谱仪和Agilent 6470 Triple Quad LC/MS三重四极杆质谱仪,美国Agilent公司); Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司); E0301平行研磨仪(中国天津阿尔塔科技有限公司); XSE105 Dual Range分析电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SCDEALL VX-Ⅲ Multi-Tube Vortexer多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司);甲醇和乙腈(质谱级,德国Merck公司);甲酸(质谱级,美国Sigma-Aldrich公司)。

标准品:6-姜酚(6-gingerol, CAS号:23513-14-6,纯度98.9%)、8-姜酚(8-gingerol, CAS号:23513-08-8,纯度99.5%)、10-姜酚(10-gingerol, CAS号:23513-15-7,纯度97.5%)、6-姜烯酚(6-shogaol, CAS号:555-66-8,纯度97.6%)、8-姜烯酚(8-shogaol, CAS号:36700-45-5,纯度98.3%)、10-姜烯酚(10-shogaol, CAS号:36752-54-2,纯度98.1%)、四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin, CAS号:36062-04-1,纯度99.7%)、姜黄素(curcumin, CAS号:458-37-7,纯度98.9%)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin, CAS号:22608-11-3,纯度98.0%)、双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin, CAS号:24939-16-0,纯度98.0%),均购于天津阿尔塔科技有限公司。10种标准品的化学结构式见图1。

图 1 10种营养成分的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of the 10 nutrients

实验用生姜样品采自山东省各生姜基地,收获期均为2018年11月。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取5.0 mg 10种营养成分标准品(精确至0.1 mg),用甲醇定容至5 mL,配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液,于-20 ℃冰箱储藏,备用。

吸取适当体积的各标准品储备液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准中间溶液,于-20 ℃冰箱储藏,备用。

用甲醇稀释混合标准中间溶液,配制成质量浓度为0.10～200 μg/L的混合标准工作溶液,现用现配。

表 1 10种营养成分的质谱参数

1.3 样品预处理、前处理

预处理:选取形态完整、质量约200 g的块状生姜根茎作为实验样品,去除泥土,用水洗净,拭干表面;不去皮切成小块,装入研磨杯,使用平行研磨仪充分研磨,然后转移至塑封袋中,于-20 ℃保存,待用。

前处理:称取(500±0.5) mg生姜样品的均一研磨物,置于50 mL具塞离心管中,加入25 mL甲醇,封盖,涡旋10 s,短暂混合,置于涡旋振荡器,提取2 min,静置10 min,取1 mL上清液,过0.2 μm有机滤膜。由于样品中某些营养成分含量非常高,需用甲醇逐级稀释配制成不同稀释倍数的系列样品溶液,以备上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温:30 ℃;流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～2.5 min, 5%B～40%B; 2.5～4.5 min, 40%B～85%B; 4.5～4.6 min, 85%B～5%B; 4.6～5.5 min, 5%B。进样量:2.0 μL。

1.5 质谱条件

离子源:喷射流离子聚焦-电喷雾电离(Jet Stream ESI)源;离子模式:正离子模式;扫描方式:多反应监测(MRM)模式;鞘气温度和流速:250 ℃和11.0 L/min;喷嘴电压:500 V;毛细管电压:4 000 V;雾化气压力:0.31 MPa;干燥气温度和流速:300 ℃和5 L/min;以上干燥气、雾化气、碰撞气、鞘气均为高纯氮气(N2)。

10种营养成分的监测离子对信息、碎裂电压(fragmentor)和碰撞能(collision energy)等质谱参数见表1。

表 1 (续)

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

采用了喷射流离子聚焦-电喷雾电离源,该技术通过加热鞘气加速溶剂蒸发并降低离子逸散,从而提高离子生成及传输效率,增强质谱的离子采样率,获得更好的检测灵敏度。在电喷雾电离条件下,采用正离子模式使目标分子较易获得1个质子,从而形成稳定的[M+H]+准分子离子峰。

分别采用100 μg/L的单一标准溶液上机分析，确认每种目标营养成分的母离子和子离子。选择一级质谱全扫描模式寻找母离子;选择离子监测模式优化出母离子响应最佳时的碎裂电压,以保证母离子的传输效率;选择子离子扫描模式进行二级质谱全扫描,寻找响应最好的2～3个子离子,同时优化每个子离子响应较高的碰撞能;最后选择多反应监测模式扫描,对碰撞能进一步优化,得到子离子响应最佳时的碰撞能。

其中值得注意的是,欧盟方法学标准对质谱方法定性确证的要求是满足最低“4分法”,以每个母离子为1分,每个子离子为1.5分计[18],因此对LC-MS/MS而言,需至少有2对离子对方可实现对目标物的准确定性。在选择子离子时,排除了相对分子质量小于50的离子以及中性丢失离子(如脱水离子)。在完成了母离子和子离子确认以后,采用自动优化程序和手动优化程序同时确证优化出最优的碎裂电压与碰撞能。

10种目标营养成分的分子结构具有一定的相似性,如3种姜酚均具有典型的β-羟基酮结构,由电离结果发现,相似结构特征所产生的离子碎片呈现出一定的碎裂规律,如3种姜酚及四氢姜黄素均可产生信号较强的m/z为177.1和137.1的碎片离子峰,3种姜烯酚均可产生信号较强的m/z为137.1和m/z122.1的碎片离子峰,去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素均可产生m/z为147.0的碎片离子峰。在4种姜黄素类营养成分中仅四氢姜黄素能够产生信号较强的m/z为137.1的碎片离子峰,同时仅双去甲氧基姜黄素未能产生m/z为177.1的碎片离子峰。由此分析可知,可以通过选择恰当的特征离子碎片从而鉴别推断各物质的裂解规律,还可为生姜中更多具有相似结构功能的化合物的发现提供一定依据。

2.2 色谱条件的优化

液相色谱条件影响目标化合物的离子化效率,影响其色谱峰分离行为与峰形,为获得理想的色谱分离效果和更高的检测灵敏度与准确性,实验对流动相组成、柱温以及梯度洗脱程序进行了优化。选用常见的甲醇-水体系和乙腈-水体系作为流动相进行考察,发现在两种流动相体系下各目标化合物均能出峰,但在甲醇-水体系下表现出更高的响应,故采用了甲醇-水体系。结合10种目标化合物具有较强极性的结构特点,在流动相中分别添加0.1%(v/v)甲酸有利于改善峰形。为使10种营养成分实现良好分离,采用梯度洗脱不断调节流动相各部分比例,使得在1.4节梯度条件下,各目标物的色谱峰在5.5 min内实现较好分离。10种营养成分混合标准溶液(50 μg/L)的总离子流色谱图见图2。

图 2 10种营养成分混合标准溶液(50 μg/L)的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion chromatograms of the 10 nutrients (50 μg/L) in the mixed standard solution

2.3 线性关系、检出限和定量限

将10种营养成分的混合标准储备液用甲醇稀释配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的系列标准工作液,以各营养成分的质量浓度为横坐标(X, μg/L),色谱峰面积为纵坐标(Y)绘制标准工作曲线,进行线性回归分析并计算相关系数(r),结果见表2。这10种营养成分的r为0.999 5～0.999 9,说明其线性关系良好,满足检测要求。

表 2 10种营养成分的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

由于生姜样品中本身含有待测物,且其中一些成分的本底值很高,因此不能获得空白基质。对目标物检测并计算信噪比(S/N)值,得出S/N均大于10,说明生姜中各目标物含量高于分析方法的定量限。考虑到实际应用中可能出现目标物含量接近或低于方法定量限等情况,故对方法的检出限和定量限作进一步考察。将待测试样稀释100倍、1 000倍后,再检测并计算S/N,以S/N大于3和大于10(同时符合回收率和精密度要求)确定10种目标物的检出限和定量限,二者分别为0.04～2.02 μg/L和0.10～7.71 μg/L。10种营养成分的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限见表2。

2.4 回收率和精密度

由于生姜本身含有待测营养成分,无法得到空白基质样品,为考察检测方法的准确度和精密度,采用样品加标回收法进行评价。取同一样品的子样两份,一份不加标,另一份加入适量的10种营养成分的标准溶液,按1.3节和1.4节处理并上机测定,以二者测定结果的差值与理论加标值之比计算回收率。

因实际样品中各营养成分的含量水平不一,需先明确各营养成分适合的样品溶液稀释倍数以及该稀释倍数下的基质背景值,保证加标的量值与基质背景值接近,且不加标样品与加标样品的测定值都在线性范围内。每种营养成分分别设置3个添加水平(见表3),每个水平平行测试6次,考察日内、日间精密度。实验结果显示,10种营养成分的平均加标回收率为82.8%～115.3%,相对标准偏差(RSD)为0.58%～11.49%,回收率和精密度良好(见表3)。

2.5 实际样品测定

应用本方法测定生姜样品56份。样品于2018年11月采自山东省各市县的生姜种植基地。通过绘制箱形图对该批生姜样品中各营养成分的含量进行分析,结果显示,56份生姜样品中10种营养成分均有检出,并且它们的含量水平存在较大差别。生姜样品中10种营养成分含量水平的离散分布结果见图3。

该批生姜样品中,6-姜酚的含量范围为182.63～1 028.33 mg/kg,图中四分位距表示6-姜酚含量的集中分布,范围为373.35～702.48 mg/kg。总体上看,10种营养成分含量呈现出5个水平,分别是:6-姜酚为100～1 200 mg/kg;10-姜酚、8-姜酚为10～300 mg/kg;6-姜烯酚、四氢姜黄素为0.2～10 mg/kg;10-姜烯酚、8-姜烯酚、姜黄素、去甲氧基姜黄素为0.02～2.0 mg/kg;双去甲氧基姜黄素为<0.02 mg/kg。本实验结果说明生姜中姜辣素类营养成分的含量比姜黄素类的高。6种姜辣素中,姜酚(6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚)含量高于姜烯酚含量(6-姜烯酚、10-姜烯8-姜烯酚); 6-姜酚含量高于10-姜酚和8-姜酚;6-姜烯酚含量高于10-姜烯酚和8-姜烯酚。4种姜黄素中,四氢姜黄素的含量高于姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素,双去甲氧基姜黄素含量相对最低。

表 3 生姜样品中10种营养成分在3个加标水平下的平均回收率和RSD(n=6)

图 3 生姜样品中10种营养成分含量水平的离散分布Fig. 3 Discrete distribution of the contents of the 10 nutrients in ginger samples

3 结论

本文建立了一种超高效液相色谱-串联质谱快速测定生姜中10种营养成分的分析方法。该法分析时间快,能够实现对目标物的准确定性和定量,适用于生姜中姜辣素类和姜黄素类营养成分的同步分析,可为生姜的品质鉴定与质量控制提供技术手段。