益气化瘀解毒方、超低频电磁场处理水对ARDS大鼠血清IL-4、IL-10水平的影响*

骆长永 李 雁△ 李 昕 梁 旭 杨润宇 吴元德 王 欣

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京市通州区中西医结合医院，北京101100；3.中国医学科学院基础医学研究所，北京 100730；4.广东骏丰频谱股份有限公司，广东 广州 510000）

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由多种肺内原因（如肺炎、误吸等）或肺外疾病（如脓毒症、胰腺炎、创伤）引起，以进行性低氧血症、呼吸窘迫为特征的临床危重症。尽管其发病机制尚不明确，但炎性细胞失控活化，进而造成广泛的内皮屏障损伤，在发病过程中起关键的作用；导致炎性细胞失控活化的重要原因之一是促炎因子与抑炎因子表达失衡，这一点已为学术界所公认［1］。ARDS的治疗以保护性机械通气、限制性液体管理等支持治疗和控制原发病为主，无特异性治疗方法，病死率仍在40%以上［2］。因此，迫切需要在对ARDS的发病机制进行深入探讨的基础上，寻找安全、有效的治疗方法。益气化瘀解毒方是由首都国医名师、北京中医药大学东直门医院杜怀棠教授提供的经验方。杜怀堂教授是本课题组的指导老师，研究采用的益气化瘀解毒方的剂型、用量等均得到了杜老师的认可。前期动物实验显示［3-5］，益气化瘀解毒方可减少白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等蛋白的表达，以及降低核转录因子-κB（NF-κB）通路关键蛋白p65的表达，证明益气化瘀解毒方可通过降低促炎因子表达及抑制促炎通路活化，起到保护肺组织的作用。频谱水是一种经过超低频电磁场处理后的功能水，即将普通饮用水的物理化学特性改变，如更小的水分子团簇，更高的介电常数［6］，安全没有毒害作用，并且可以提高免疫系统功能［7］。本研究通过观察益气化瘀解毒方、频谱水对ARDS大鼠血清重要抑炎因子IL-4、IL-10表达水平的影响，探讨益气化瘀解毒方、频谱水调控ARDS炎性反应的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠36只，（北京维通利华实验动物技术有限公司），8周龄，体质量（200±10）g。饲养于实验动物中心屏障实验室（北京中医药大学东直门医院），实验室温度设置为22～24℃，湿度固定在50%～70%，且给予相同标准的普通颗粒饲料，分笼饲养，每笼6只，自由饮水。适应性喂养1周后再进行实验。本次实验动物研究已通过北京中医药大学东直门医院实验动物福利与伦理委员会审批。

1.2 试剂与仪器 益气化瘀解毒方：黄芪30 g，黄芩10 g，金银花15 g，三七10 g，赤芍15 g，炒枳实12 g，葶苈子15 g，桑白皮15 g。药物由中国中医科学院中药研究所提供，并制作成中药浸膏，批号为20170320。大肠杆菌脂多糖（LPS）（美国Sigma公司生产，产品批号110M4086V）100 mg；IL-4 ELISA试剂盒（美国Abcam公司生产，批号A100770）；IL-10 ELISA试剂盒（美国Abcam公司生产，批号A1000776）；PBS溶液（美国Sigma公司）。精密电子天平；药物天平HC·TP11·10（上海精密仪器仪表有限公司）；BH2生物显微镜（日本OLYMPUS公司）；切片机EICA（德国LEICA公司）；高速离心机（美国Thermo公司）；超低温冰箱702（美国Thermo公司）。频谱水治疗仪JF-118B（广东骏丰频谱股份有限公司）。

1.3 分组及造模 将36只实验动物随机分为6组，每组6只，即空白对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、频谱水组，分别称质量并记录。采用的ARDS动物模型为一次尾静脉注射LPS诱导全身炎症反应所致。全身炎症反应是引起ARDS最主要的病因，模型满足ARDS肺组织病理特点，造模方法稳定，学术界认可。第7天灌胃后6 h，空白对照组尾静脉注射0.9%氯化钠注射液，2 mg/kg体质量，其余各组予LPS溶液一次性尾静脉注射，2 mg/kg体质量。取材前8 h大鼠禁食水。

1.4 给药方法 将制备好的中药浸膏配置成不同浓度的中药溶液，结合既往实验研究，中药低剂量组按6.1 g/（kg·d）（给药剂量为生药剂量），即成人3倍，中药中剂量组按12.2 g/（kg·d）（给药剂量为生药剂量）予益气化瘀解毒方溶液灌胃给药，即成人6倍，中药高剂量组按24.4 g/（kg·d）（给药剂量为生药剂量）给药，即成人12倍。空白对照组、模型组按每日灌胃量为1 mL/100 g灌服蒸馏水，频谱水组每日灌胃量为1 mL/100 g灌服超低频电磁场处理水，连续灌胃或灌水7 d，频谱水组日常饮用超低频电磁场处理水，余各组均正常饮食水；以上药物均由蒸馏水配制，配置药液及蒸馏水均存放于4℃冰箱中，灌胃前用60℃温水浴热后再灌胃。

1.5 标本采集与检测 1）肺大体。造模16 h后各组全部麻醉下取材，用精密天平称质量，记录，置于操作台，肉眼观察并记录肺脏的淤血程度、肿大程度、被膜色泽等病理变化，用数码摄像机拍照记录。2）肺组织病理。取右下肺进行HE染色病理切片，在光学显微镜下观察以下指标：大鼠肺泡间隔变化，炎症细胞浸润程度，肺毛细血管充血水肿状况等组织形态学变化。经组织切片、常规脱蜡、苏木素染色、分色、脱水、封片等步骤，在显微镜下观察各组肺组织病理情况。肺组织病理切片及HE染色于北京中医药大学东直门医院病理室制作完成。3）酶联免疫法（ELISA）检测血清IL-4、IL-10表达水平。取腹主动脉血3～5 mL于肝素化的试管中，经3 000 r/min低温离心20 min后，取血清置于-80℃冰箱中保存备用。按照ELISA试剂盒操作说明进行测定。检测IL-4表达水平时，将血清样本PBS稀释5倍后测定。检测IL-10表达水平时，将血清样本PBS稀释8倍后测定。

表1 各组处理方法一览表

1.6 统计学处理 计量数据以（）表示，使用Graphpad Prism7软件进行数据分析及作图，利用单因素方差分析（ONA-way ANOVA）进行差异显著性检验。各组间两两比较时先进行Levene方差齐性检验，满足方差齐性时釆用LSD-t检验，不满足方差齐性时釆用Dunnetts-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组大鼠肺大体观察结果比较 见图1。空白对照组大鼠肺脏红润有光泽，无肿胀，切面无渗血、渗液；模型组大鼠肺脏体积明显增大，肺组织明显水肿，颜色暗红，表面可见散在的大小不等的暗红色斑片状的出血点；各治疗组大鼠肺脏肿胀不同程度减轻，体积增大，颜色淡红，可见少量出血点，切面少量淡红色液体渗出。

2.2 各组大鼠肺组织病理观察结果 见图2。空白对照组大鼠的肺组织病理：肺泡结构清晰、完整，肺泡间隔无水肿，肺泡腔内未见组织液，肺组织中未见炎性细胞浸润；模型组大鼠的肺组织病理：肺泡及肺间质水肿并有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚并可见肺泡腔缩小变形，部分肺泡塌陷，支气管腔和肺泡腔可见大量分泌物，内含红细胞，肺毛细血管充血水肿；各治疗组大鼠的肺组织病理，较模型组损伤程度减轻，少量炎性细胞浸润，肺泡结构完整，细胞塌陷较少，出血、渗出较少，肺微血管内皮水肿较轻。

图1 各组肺大体情况

图2 各组肺组织病理情况（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠血清IL-4、IL-10表达水平比较 见表2。与空白对照组比较，大鼠血清中IL-4表达水平在模型组中显著降低（P＜0.01）；各治疗组大鼠血清IL-4表达水平均显著高于模型组（P＜0.01），中药各组中中药中剂量组IL-4表达水平最高，频谱水组与中药中剂量组升高水平相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明中药干预ARDS模型大鼠，可升高其大鼠血清中IL-4蛋白表达水平，频谱水可以起到与中药相近的干预效果。与空白对照组比较，大鼠血清IL-10在模型组表达水平升高（P＜0.01）；中药低剂量组较模型组降低；中药中剂量组、中药高剂量组、频谱水组血清IL-10表达水平均高于模型组（P＜0.01），中药中剂量组较其他各治疗组升高水平最为显著。说明中药中、高剂量干预ARDS模型大鼠可提高其血清中IL-10蛋白表达水平，频谱水可升高IL-10蛋白表达水平，中药中剂量干预效果最为显著。

表2 各组大鼠血清IL-4、IL-10表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清IL-4、IL-10表达水平比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别空白对照组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组频谱水组n 6 6 6 6 6 6 IL-4（pg/mL）62.43±4.20 15.10±4.40**28.33±3.45△△34.20±4.12△△28.31±5.15△△34.98±3.02△△IL-10（ng/mL）0.83±0.24 1.67±0.14**1.12±0.06△△3.13±0.13△△2.74±0.11△△2.58±0.08△△

3讨论

3.1 IL-4、IL-10在ARDS发病中的作用 炎症级联反应是ARDS发病的关键病理环节，根据细胞因子在急性呼吸窘迫综合征中的作用不同可分为促炎因子和抑炎因子，促炎与抑炎的失衡是炎症细胞失控活化的重要原因。大量的实验和临床证据也证明，促炎细胞因子和抑炎细胞因子在急性呼吸窘迫综合征的疾病发展过程中起着关键的作用。ARDS患者肺部炎症反应的复杂性，通过单一的细胞因子检测难以获得可靠的结果，必须在促炎和抑炎平衡的背景下加以理解［8］。IL-4由活化的T细胞产生的多效性细胞因子。IL-4可抑制促炎因子IL-1、TNF-α的表达，在ARDS发病过程中，被认为是一种保护性抑炎因子。活化的肺泡巨噬细胞可分为两种主要表型：M1和M2巨噬细胞，M2巨噬细胞有助于组织修复，由于它们的抗炎作用，通过释放Th2细胞因子如IL-10、IL-13等发挥生物学功能［9］。IL-10主要为单核细胞产生的细胞因子，在较小程度上由淋巴细胞产生。该细胞因子在免疫调节和炎症中具有多效性作用。研究发现，IL-10在ARDS患者的第1天达到峰值，并且在第21天缓慢下降到检测不到的水平，IL-10浓度的观察结果提示ARDS发作时有显著的抗炎作用［8］。早期ARDS患者支气管肺泡灌洗液中的抗炎细胞因子IL-10浓度的降低与预后不良密切相关。提示增加抗炎细胞因子将是对ARDS患者有益的治疗方法［10］。本次实验结果显示IL-10在模型组较正常组显著升高，并不符合IL-10在模型组降低的预期。结合以上文献，IL-10在ARDS发病中可能早期升高，后逐渐减低，仍可说明IL-10的抗炎作用以及其减低将预示患者预后不佳。

3.2 益气化瘀解毒方及超低频电磁场处理水的作用机理分析 中医以临床证候为出发点，针对病因病机进行辨证论治。Meta分析显示，中西医结合治疗ARDS较西医常规治疗在降低病死率等方面，有明显优势［11］。ARDS患者多以感受邪毒，壅滞于肺，灼伤气阴，瘀血内停，致肺气虚衰，肺气衰败，气机逆乱而发病［12-13］。本实验采用的益气化瘀解毒方是由杜怀堂教授提供的经验方，其组成为黄芪、金银花、黄芩、三七、赤芍、桑白皮、葶苈子、炒枳实。杜怀堂教授认为，其中黄芪为君，补肺气以扶正，金银花、黄芩为臣清肺热以解毒，三七、赤芍为臣化瘀血以通络，桑白皮、葶苈子、炒枳实共为佐药泻肺平喘，通腑理气，全方以益气扶正为主，兼以解毒化瘀，使肺气得振，毒热得解，喘促则息。因此，本团队经过前期动物实验验证了益气化瘀解毒方对促炎因子及其通路的抑制作用［3-5］，结合益气化瘀解毒方“扶正祛邪”的治疗原则以及中药复方多成分、多靶点的作用机制，本次实验证明了益气化瘀解毒方可升高血清IL-4、IL-10的表达水平，共同证明益气化瘀解毒方可能通过调控促炎因子与抑炎因子表达平衡，达到防治肺组织损伤的作用。频谱水是具有特殊物理化学性质的一种特殊处理水。动物实验研究表明，频谱水可以改善血流动力学指标，改善微循环，同样具有抗氧化、提高免疫系统的功能等作用。频谱水对正常张力性青光眼等微循环减少的疾病有较显著的改善作用［14］。超低频电磁场处理水在一定程度上可改善胰岛素抵抗大鼠血脂水平，也可以降低高脂饮食引起的肝功能紊乱程度［15］。研究显示［3］，频谱水可减低ARDS模型大鼠血清中IL-8、TNF-α的表达水平。本次实验结果显示，频谱水可升高ARDS模型大鼠血清中IL-4、IL-10的表达水平，说明频谱水对促炎因子与抑炎因子平衡系统具有一定的调控作用。

综上所述，经益气化瘀解毒方、频谱水治疗后，模型大鼠肺脏肿胀程度、表面色泽、出血点等情况均有减轻，肺组织病理出血、水肿程度改善，炎性细胞渗出减少。除中药低剂量组外，各治疗组干预ARDS模型大鼠，可升高其大鼠血清中IL-4、IL-10蛋白表达水平，中药中剂量干预效果最为显著，频谱水可以起到与中药相近的干预效果。因此，益气化瘀解毒方对LPS诱导的ARDS大鼠具有保护作用，可能与通过升高血清中抑炎因子IL-4、IL-10表达水平有关；超低频电磁场处理水治疗有升高抑炎因子表达水平、减轻肺组织损伤作用。