活血益气中药抑制心梗后心衰大鼠左室重构和心肌细胞凋亡的实验研究*

张海燕 迟春梅 刘天易

（1.山东省青岛市即墨区中医医院，山东 青岛 266200；2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250100）

心肌梗死为常见多发性心血管病，是一种复杂的临床综合征，是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂，血小板和凝血功能异常，血栓完全阻塞冠状动脉所致。心梗后心衰发展过程的重要病理机制为心肌重塑，包括心室大小、形态及细胞水平变化，心肌细胞的缺失和心室重构下降使心脏功能下降［1-2］。研究发现VEGF可形成新的血管，增加血管的通透性，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）下降抑制心肌细胞肥大和胶原产生，内皮素-1

（ET-1）血管收缩剂和促细胞分裂剂，ET-1生成和释放，刺激肺血管持续收缩［3-4］。Bcl-2和Bax为Bcl-2家族成员，主要调节细胞凋亡，决定细胞的生存或死亡，可调控心梗后心衰促凋亡和抗凋亡［5］。活血益气中药对心梗后心衰具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不明确［6-7］。因此，本研究旨在探讨早期应用活血益气中药抑制心梗后心衰大鼠左室重构和心肌细胞凋亡的作用特点。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 30只健康雄性清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量（250±20）g。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2011-0011。自然光线，分笼饲养，标准喂养。

1.2 试药与仪器 活血益气方：丹参15 g，川芎20 g，红花15 g，黄芪20 g，赤芍10 g，党参10 g。药材均为笔者所在医院中药房提供，取处方药材，加8倍量水煎煮2次，滤过，并制成生药含量1 g/mL的煎煮液。卡托普利（广东彼迪药业有限公司），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），HE染色液（Sigma公司），VEGF、ET-1试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司，AngⅡ试剂盒购于北京富瑞生物工程公司。TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒美国eBioscience公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪，日本奥林巴斯有限公司；SMZ660荧光显微镜，日本尼康公司；Bioteka Quant型酶标仪，上海坤肯生物化工有限公司；DH-140B型小动物呼吸机，浙江医科大学实验仪器厂。

1.3 模型制备 40只SD大鼠饲养1周，水合氯醛麻醉大鼠后，固定于手术台，碘酒消毒，在左胸第4肋骨间作横切口，打开胸腔，使心脏充分暴露于外，剥离心包膜，冠状动脉前降支起点处结扎前降支、心脏搏动稍减弱，心电图出现ST段上抬，抬高到弓背向上为造模成功。逐层缝合皮肤，清除术野，关闭切口。腹腔注射青霉素3 d，200万/（kg·d），预防感染［8-9］。假手术组大鼠手术过程同上，只穿线但不结扎冠脉。

1.4 分组与给药 将模型大鼠随机分为中药组、西药组和模型组，每组10只。中药组给予活血益气方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西药组给予卡托普利灌胃，剂量为100 mg/kg，每日1次。对照组和模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。连续灌胃4周。

1.5 标本采集与检测 采用小动物呼吸机检测左室收缩内径（LVS）、左室舒张內径（LVD）、左室射血分数（EDV）和左室每搏输出量（SV）。检测完心功能后，剪开胸腔，迅速取出心脏，0.9%氯化钠注射液清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。取血清，采用双抗体夹心-ELISA法定量测定的VEGF、AngⅡ和ET-1水平，严格按照说明书操作。TUNEL试剂盒检测心肌细胞凋亡，凋亡指数（AI）=凋亡心肌细胞数÷心肌细胞总数×100%。取心肌组织提取RNA，检测提取的RNA纯度，RNA经反转录后，采用RT-PPCR法检测凋亡基因Bcl-2和Bax mRNA水平，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，据美国国立生物技术信息中心（NCBI）公布的大鼠Bcl-2和Bax基因序列，设计引物，引物序列见表1。95℃变性，60℃退火，40个循环。计3个复孔，以重水为阴性对照。根据标准曲线及待测样本二阶导数最大分析法计算的Ct值，计算mRNA含量。

表1 RT-PCR所用引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，t检验比较组内和组间差异，计数资料以n（%）表示，χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组大鼠病理组织比较 对照组心肌细胞正常，无坏死，模型组心肌细胞坏死，结缔组织增生，中药组和西药组心肌细胞坏死减少，存在轻微结缔组织增生。见图1。

图1 心肌组织病组织（HE染色，40倍）

2.2 各组大鼠心功能指标比较 见表2。中药组和西药组左室LVS和LVD显著低于模型组，左室EDV和SV显著高于模型组（P＜0.05）。

表2 各组心功能指标比较（±s）

表2 各组心功能指标比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组别对照组模型组中药组西药组n 10 10 10 10 LVS（mm）0.73±0.09 0.57±0.04*0.39±0.05*△0.37±0.04*△LVD（mm）0.53±0.07 0.72±0.05*0.66±0.04*△0.65±0.04*△EDV（%）67.14±4.59 41.23±3.12*48.12±3.74*△46.43±3.62*△SV（mL）75.12±18.67 48.47±12.86*59.57±13.45*△61.15±12.56*△

2.3 各组大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比较 见表3。中药组和西药组VEG、AngⅡ和ET-1水平显著低于模型组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比较（±s）

表3 各组大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比较（±s）

组别对照组模型组中药组西药组n 10 10 10 10 VEGF（pg/mL）142.14±22.34 243.21±42.49*167.19±21.35*△164.47±20.61*△AngⅡ（ng/mL）1.71±0.32 3.12±0.41*2.03±0.35*△1.98±0.31*△ET-1（%）45.37±7.24 68.47±8.26*52.12±6.21*△51.43±5.69*△

2.4 各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI水平比较 见表4。中药组和西药组Bcl-2 mRNA水平显著高于模型组Bax mRNA显著低于模型组（P＜0.05），中药组和西药组AI显著低于模型组，且低于对照组（P＜0.05）。

图2 各组心肌细胞的凋亡情况（400倍）

3讨 论

心肌梗死后左心室扩张和收缩功能障碍，冠状动脉粥样硬化斑块破裂，心肌细胞死亡伴随有大量心肌细胞凋亡，心肌细胞肥大和间质增生，随着病情的发展，心肌细胞凋亡持续存在，心肌细胞缺失和心室重构是心衰的主要原因［10-11］。心肌细胞凋亡激活神经内分泌系统，增加血清VEGF、AngⅡ和ET-1表达，促进心肌细胞肥大和胶原产生，体内水、钠潴留，进一步损害心脏舒缩功能，导致心肌肥厚、心室重构和纤维化［12］。ET-1通过加重心脏负荷，损伤缺血再灌注，加重心肌缺血［13］。利尿剂是治疗心衰的首选药，可减轻体肺循环淤血及心脏前负荷，其不能被其他心血管药物替代，常用药物还有血管扩张剂、钙增敏剂、促红细胞生成素、内皮素Ⅰ拮抗剂等，药品造价昂贵难以推广［14］。中医心衰属于胸痹、痰饮、心水等范畴，心气虚是其基本的病机，外因多为风、寒、湿、热等，内因多为饮食失宜，脏腑内伤，本虚标实，本虚为气虚为主，血瘀为其标，治宜活血益气［15］。

本研究发现，对照组心肌细胞正常，无坏死，模型组心肌细胞坏死，结缔组织增生，中药组和西药组心肌细胞坏死减少，存在轻微结缔组织增生，说明活血益气中药可改善心梗后心衰大鼠病理组织，这与丹参可抑制心肌成纤维细胞分裂，川芎、红花均活血化瘀，提高细胞内超氧化物歧化酶的生物活性，改善局部血液循环，抑制平滑肌细胞及成纤维细胞增生有关［16-17］。中药组和西药组左室LVS和LVD显著低于模型组，左室EDV和SV显著高于模型组，说明活血益气中药可改善心梗后心衰大鼠心功能。黄芪强心苷改善心室肌收缩和舒张，有效逆转损伤心室，党参、黄芪改善心脏的收缩、舒张功能，川芎、红花抗凝、抗氧化、扩张血管、改善微循环以及保护血管内皮有关［18-19］。中药组和西药组VEGF、AngⅡ和ET-1显著低于模型组，说明活血益气中药可降低心梗后心衰大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1表达。川芎促进心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生，减少左心室重构，改善心功能，提高心肌抗缺血能力，修复损伤心肌细胞，降低VEGF、AngⅡ和ET-1表达［20］。中药组和西药组Bcl-2 mRNA水平显著高于模型组，Bax mRNA显著低于模型组，说明活血益气中药可改善心梗后心衰大鼠凋亡基因。活血益气方可抑制心肌细胞凋亡，促进心肌抗凋亡基因的表达，改善心功能，降低心肌细胞凋亡数。

表3 各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比较（±s）

表3 各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比较（±s）

组 别n Bcl-2 mRNA Bax mRNA AI（%）10 10 10 10对照组模型组中药组西药组1.00±0.14 0.15±0.03*0.51±0.06*△0.53±0.07*△1.00±0.09 1.69±0.11*1.17±0.09*△1.15±0.1*△15.12±2.24 71.47±5.26*46.12±4.37*△47.01±3.78*△

综上所述，活血益气中药可抑制心梗后心衰大鼠左室重构和心肌细胞凋亡，可能与改善心功能、VEGF、AngⅡ和ET-1表达，调控心肌基因表达有关。